Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 EBV, HLA trên ung thư vòm mũi họng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ . TRỊNH THỊ HỒNG CỦA NGHIÊN CỨU TỶ LỆ BIỂU LỘ VÀ ĐỘT BIẾN GEN LMP1 CỦA VIRUS EPSTEIN-BARR VÀ HLA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG TẠI THÀNH PHỐ CẦN THƠ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 62 42 02 01 Cần Thơ - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ . TRỊNH THỊ HỒNG CỦA NGHIÊN CỨU TỶ LỆ BIỂU LỘ VÀ ĐỘT BIẾN GEN LMP1 CỦA VIRUS EPSTEIN-BARR VÀ HLA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG TẠI THÀNH PHỐ CẦN THƠ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 62 42 02 01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs. Trần Ngọc Dung Gs.

Phan Thị Phi Phi Cần Thơ - 2020 TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Luận án “Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của Virus Epstein-Barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Thành phố Cần Thơ” do nghiên cứu sinh Trịnh Thị Hồng Của thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGs.Trần Ngọc Dung và Gs.Phan Thị Phi Phi. Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án PGs.Trần Ngọc Dung Trịnh Thị Hồng Của i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cám ơn cô PGs.Trần Ngọc Dung (hướng dẫn chính) và cô Gs.Phan Thị Phi Phi (hướng dẫn phụ) đã tận tình hướng dẫn tôi từng bước trong phương pháp nghiên cứu khoa học, giúp tôi hiểu rõ hơn về bệnh học ung thư vòm mũi họng, cũng như luôn động viên và cho tôi lời khuyên khi gặp khó khăn trong các giai đoạn nghiên cứu của luận án này. Xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Khoa sau đại học Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ sinh học, Ban Giám Đốc, lãnh đạo các Khoa (Khoa khám chữa bệnh, Khoa nội soi, Khoa ngoại tổng hợp 1, Khoa xạ trị, Khoa Giải phẫu bệnh) và các Bác sĩ đồng nghiệp, các điều dưỡng tại các Khoa, các Phòng ban của Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thực hiện các thủ tục, thu nhận mẫu bệnh phẩm nghiên cứu. Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến 108 bệnh nhân mắc bệnh ung thư vòm mũi họng đã sẵn lòng cung cấp thông tin cá nhân, bệnh tật của mình để tôi có thể hoàn thành quyển luận án.

Tôi xin tri ân người bệnh và đây cũng là người thầy giúp đỡ tôi trong quá trình tiếp cận với tri thức Y khoa. Xin cám ơn gia đình, các thầy/cô ở Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ sinh học, các thầy/cô ở Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, đã động viên, hỗ trợ trong nghiên cứu, trong công tác và cả trong cuộc sống để tôi có thời gian hoàn thành được chương trình đào tạo. Một lần nữa, tôi xin chân thành cám ơn. Trịnh Thị Hồng Của ii TÓM TẮT Ung thư vòm mũi họng (UTVMH - NPC: Nasopharyngeal Carcinoma) là khối u ác tính xuất phát chủ yếu từ lớp tế bào biểu mô phủ vòm mũi họng với các mức độ biệt hóa khác nhau.

Đây là một trong mười loại ung thư hàng đầu và cũng là ung thư thường gặp nhất trong các loại ung thư vùng đầu mặt cổ ở Việt Nam. Bệnh UTVMH thường được chẩn đoán muộn vì nhiều lý do và dẫn đến kết quả điều trị kém đi và làm tỷ lệ tử vong tăng cao. Các nghiên cứu trước cho thấy, trong các yếu tố sinh bệnh chính, nhiễm virus Epstein-Barr (EBV) được xem là yếu tố quyết định trong bệnh sinh học của UTVMH nên được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, đặc biệt là gen Latent Membrane Protein 1 (LMP1) EBV được tìm thấy trong hầu hết các mô sinh thiết vòm mũi họng của bệnh nhân UTVMH. Kiểu đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV có liên quan chặt chẽ cho sự phát triển khối u ác tính tại biểu mô vòm mũi họng ở các bệnh nhân (BN) có nhiễm EBV.

Bên cạnh đó, do đặc điểm bệnh sinh học của UTVMH còn liên quan đến yếu tố cơ địa gen Human Leukocyte Antigen (HLA) nhạy cảm với UTVMH và điều này đã làm nên đặc tính khác nhau về tỷ lệ bệnh giữa các vùng miền. Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ hiện diện và đột biến gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết của BN UTVMH và xác định tần suất phổ biến của các alen HLA trên các BN nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 108 mẫu mô sinh thiết vòm của BN đã được chẩn đoán xác định là UTVMH tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ. Nghiên cứu thực hiện kỹ thuật PCR cổ điển với cặp mồi đặc hiệu LMP1 (168373-168174) và kỹ thuật giải trình tự gen LMP1 để phát hiện sự hiện diện gen LMP1 và kiểu đột biến gen LMP1.

Kết quả cho thấy, tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV trên mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH là 64,8% (70/108), kiểu đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 qua kỹ thuật điện di sản phẩm khuếch đại là 72,9% (51/70) và nghiên cứu đã xác nhận kết quả đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 bằng kỹ thuật giải trình tự gen LMP1 với tỷ lệ là 75,8% (25/33). Vị trí đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV là 168266-168295 và một số đột biến thay thế nucleotide như 168225A>T, 168295T>A, 168308A>G, 168320T>C. Bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide probes (PCR-SSO) nghiên cứu đã xác định tần suất của các alen HLA xuất hiện cao ở BN nghiên cứu là -A*02 (40,4%), -A*11 (21,2%), -A*24 (21,2%); -B*15 (25%), -B*46 (23,1%), -B*38 (9,6%), -B*07 (7,7%); -DRB1*12 (17,3%) và -DRB1*09 (13,8%); -DQB1*03 (44,7%), -DQB1*05 (21,4%) và -DQB1*06 (17,9%); -DQA1*01 (35,7%), - DQA1*03 (28,6%) và -DQA1*06 (21,4%). Người mang alen -DRB1*08 có nguy cơ mắc bệnh UTVMH gấp 8 lần người bình thường (OR = 8,098, p < 0,05), iii ngược lại người mang alen -DRB1*12 và -DQB1*03 thì giảm nguy cơ mắc bệnh lý này (OR = 0,335, p < 0,05; OR = 0,367, p < 0,05) so với người không mang các alen này.

Liên quan giữa kiểu đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nhưng không có liên quan giai đoạn bệnh (p > 0,05). Người mang alen HLA-B*15 có nguy cơ đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV cao gấp 4,6 lần so với những người không mang alen này. Riêng alen HLA-A*02 có liên quan đến thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa (p < 0,05) và alen HLA-B*15, HLA-DQA1*03 làm giảm 12,2%, 17,8% nguy cơ mắc UTVMH ở giai đoạn muộn trên bệnh nhân nghiên cứu. Từ khóa: mô bệnh học, protein màng tiềm ẩn 1 - LMP1, virus Epstein-Barr, ung thư vòm mũi họng.

iv ABSTRACT Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is a malignant tumour originating mainly from the epithelial cell lining the nasopharynx with different degrees of differentiation. This is one of the top ten cancers and also the most common cancer among the head and neck cancers in Vietnam. The disease is often diagnosed late for a variety of reasons and as a result in poorer treatment outcomes and increased mortality. Previous studies have demonstrated that, among the main pathogenetic factors, Epstein-Barr virus (EBV) infection is considered to be the decisive factor in the pathogenesis of NPC and should be paid the most attention to research, especially the Latent Membrane Protein 1 (LMP1) of EBV is found in most nasopharynx biopsy tissue of NPC patients.

The loss 30bp mutation LMP1 EBV is strongly associated with malignant tumour growth in the nasopharynx epithelium in patients with EBV infection. In addition, due to the characteristics of NPC, it is also related to Human Leucocyte Antigen (HLA) genomic factor, which is sensitive to NPC and this has made different characteristic of diseases rates among regions. The objective of the study determined the rate of the presence and mutation of LMP1 gene of Epstein-Barr Virus in biopsy samples of NPC patients and figured out the prevalence of common HLA alleles in the study patients. The cross-sectional description research of 108 nasopharynx biopsy samples in patients diagnosed with nasopharyngeal carcinoma at Can Tho Oncology Hospital was conducted.

Classical PCR technique was implemented utilizing primer pair LMP1 (168373-168174) to detect the presence of LMP1 EBV gene and LMP1 gene sequencing technique was also conducted to ascertain LMP 1 gene mutation type. The results showed that the rate of the presence of LMP1 EBV gene was 64.8% (70/108), loss 30bp mutation in LMP1 gene accounted for 72.9% (51/70) by PCR technique and the study has confirmed the result of 30bp loss mutation by gene sequencing technique that was 75. The site of the 30bp gene LMP1 EBV mutation was 168266-168295 and some nucleotide replacement mutations such as 168225A>T, 168295T>A, 168308A>G, 168320T>C. By Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide probes (PCR-SSO) technique, the study has determined the frequencies of HLA alleles in patients that were -A*02 (40.

People who carry the allele -DRB1*08 are at risk for NPC eight times more than normal people (OR = 8.05), whereas people who carry the allele -DRB1*12 and -DQB1*03 reduce the risk of this disease (OR = 0.05) compared to people without these alleles. The relationships between 30bp loss mutation in LMP1 EBV gene with undifferentiated carcinoma in NPC patients were statistically significant (p < 0.05) but not related to the stage in the studied NPC patients (p > 0. HLA-B*15 allele was v an allele that can risk of loss 30bp mutation LMP1 EBV gene four times more than people without these alleles (with OR = 4. Particularly for HLA-A*02 allele was correlated with undifferentiated carcinoma (p < 0.

HLA-B*15 and HLA- DQA1*03 alleles can reduce the risk of late stage of disease by 12. Key words: Histopathology, Latent Membrane Protein 1 - LMP1, Epstein-Barr virus, nasopharyngeal carcinoma. vi CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án “Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của Virus Epstein-Barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Thành phố Cần Thơ” này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGs.Trần Ngọc Dung và Gs.Phan Thị Phi Phi. Các kết quả của công trình nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác.

Tác giả luận án Trịnh Thị Hồng Của vii MỤC LỤC Trang xác nhận của người hướng dẫn khoa học.v Cam kết kết quả. vii Mục lục.viii Danh sách bảng. xii Danh sách biểu đồ.xiv Danh sách hình. xv Danh mục từ viết tắt.

xvii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU. 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.1 Sơ lược cấu trúc giải phẫu và hệ thống mạch bạch huyết vùng VMH.1 Cấu trúc giải phẫu vòm mũi họng.2 Hệ thống mạch bạch huyết vùng vòm mũi họng.2 Bệnh ung thư vòm mũi họng.2 Dịch tễ học bệnh ung thư vòm mũi họng thế giới và Việt Nam.