Khả năng phân giải muối mật của Lactobacillus từ hệ tiêu hóa người

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lã Thị Lan Anh XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2020 luan an BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lã Thị Lan Anh XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung Hà Nội - 2020 luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài:“ Xác định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của ngƣời” là do tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận hoàn toàn chính xác, trung thực.

Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều đƣợc trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này! Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2020 Học viên Lã Thị Lan Anh luan an LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu em đã đƣợc sự hƣớng dẫn và giúp đỡ rất nhiều của thầy cô và bạn bè để hoàn thành đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung - ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn nhiệt tình, giải đáp kịp thời các thắc mắc và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.

Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Đồng Văn Quyền, trƣờng phòng Vi sinh phân tử, các anh chị Vũ Thị Hiền,Trần Xuân Thạch, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Bùi Thị Dƣơng, Nguyễn Đình Duy trong phòng Vi sinh phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ em trong các thí nghiệm khi gặp những khó khăn và cũng truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý giá trong công tác nghiên cứu Sinh học. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả thầy cô giáo, giảng viên và cán bộ nhân viên Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp em có lƣợng kiến thức cơ bản nhất định để hoàn thành các môn học cũng nhƣ đề tài luận văn này. Xin cảm ơn gia đình đã động viên, là hậu phƣơng vững chắc giúp em có động lực học tập. Cuối cùng xin cảm ơn tất cả bạn bè đã bên cạnh, cùng nhau học tập và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ hoàn thành đề tài luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn! Học viên Lã Thị Lan Anh luan an DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích chữ viết tắt WHO World Health Organization - Tổ chức y tế Thế giới LAB Vi khuẩn sinh axit lactic BSH Bile salts hydrolase- Enzym thủy phân muối mật S. aureus Staphylococcus aureus Realtime Polymerase Chain Reaction – phản ứng RT-PCR chuỗi polymerase thời gian thực Pox Pyruvate oxidase Lox Lactate oxidase Nox NADH oxidase SE Staphylococcal enterotoxin De novo Tổng hợp mới MRS De Man, Rogosa & Sharpe HRP Horseradish peroxidase TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbezidine SGC Sodium Glycocholate SGDC Sodium Glycodeoxycholate STC Sodium Taurocholate STDC Sodium Taurodeoxycholate luan an DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Pha loãng H2O2 theo nồng độ khác nhau. Trình tự mồi sử dụng để khuếch đại các gen bsh.

Giá trị đo OD620nm và hàm lƣợng H2O2 có trong dịch nuôi. Tỷ lệ sống sót sau khi ủ trong môi trƣờng pH thấp của các chủng vi khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng. Tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn sau 3 giờ ủ trong môi trƣờng có bổ sung muối mật. Kết quả đo nồng độ DNA của các mẫu.

Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -08 và Lac. 56 luan an DANH MỤC HÌNH Hình 1. Đồng phân quang học của axit lactic. Cấu trúc của axit mật.

Sự tổng hợp axit mật. Hoạt động thủy phân muối mật của hệ vi khuẩn đƣờng tiêu hóa. Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc từ mẫu phân ngƣời. Khuẩn lạc Lactobacillus thuần khiết sau 24 giờ nuôi cấy.

Lactobacillus quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. ảnh nhuộm Gram. Kết quả thử hoạt tính Catalase. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus so với đối chứng.

Đƣờng chuẩn thể hiện mối tƣơng quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB. Khả năng phân giải muối mật của 5 chủng Lactobacillus. Kết quả điện di sản phẩm PCR các gen bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4 (lần lƣợt từ trái sang phải) của các chủng Lac.VFE-08 và Lac. Khả năng ức chế sự sinh trƣởng trên S.

aureus của các chủng Lactobacillus. 52 luan an Hình 3. Kết quả điện di các mẫu DNA của các chủng Lac.VFE-08 và Lac. Kết quả sản phẩm PCR của các chủng Lac.VFE-08 và Lac.

Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập Lac. VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree. 57 luan an MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỤC LỤC. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS. Vị trí, đặc điểm chung. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn Lactobacillus. Ứng dụng của Lactobacillus.

TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE SALT HYDROLASE (BSH). Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đƣờng tiêu hóa. Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN NAY.

Các nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 1 luan an 2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.

ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. Đối tƣợng nghiên cứu. Mẫu vật nghiên cứu. Hóa chất và môi trƣờng.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus. Phƣơng pháp làm sạch và giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus.

Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus. Xác định khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus. Định danh vi khuẩn. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTOBACILLUS. KẾT QUẢ LÀM SẠCH VI KHUẨN LACTOBACILLUS. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS. Kết quả xác định hình thái tế bào vi khuẩn.

Kết quả xác định khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus. Kết quả xác định khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng đƣợc chọn lọc. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS. Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trƣờng nuôi cấy.

Kết quả xác định sự có mặt của các gen bsh. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƢỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH S. ĐỊNH DANH VI KHUẨN. Kết quả tách DNA tổng số.

Kết quả PCR. Kết quả giải trình tự. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

60 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN. 71 3 luan an MỞ ĐẦU Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới WHO, tính đến hết năm 2015 trên thế giới có khoảng 2,1 tỉ ngƣời thừa cân và béo phì. Đây là một con số báo động đối với xã hội. Béo phì đƣợc đặc trƣng bởi một nhóm các rối loạn chuyển hóa mãn tính quan trọng, bao gồm tiểu đƣờng type 2, gan nhiễm mỡ, tăng huyết áp, ung thƣ.

và đặc biệt là bệnh tim mạch. Trong số các bệnh về tim thì bệnh về mạch vành gây tỷ lệ tử vong cao nhất. Tình trạng cao cholesterol trong máu làm tích tụ cholesterol trong động mạch vành, dẫn đến sự hình thành các mảng bám, gây xơ vữa động mạch, thúc đẩy sự phát triển của bệnh mạch vành. Số liệu cho thấy, nếu nồng độ cholesterol trong máu giảm 1% thì nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến mạch vành giảm tới 3%.

Những nghiên cứu gần đây cho thấy hệ vi sinh vật là một yếu tố môi trƣờng liên quan đến việc kiểm soát trọng lƣợng cơ thể. Ở ngƣời, hệ vi sinh đƣờng ruột chứa khoảng 1014 tế bào vi khuẩn với bảy nhóm chính đó là Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Cyanobacteria và Actinobacteria [1]. Các mô hình thực nghiệm cho thấy ở các đối tƣợng động vật và ngƣời béo phì có sự thay đổi trong thành phần của hệ vi sinh vật đƣờng ruột so với đối tƣợng khỏe mạnh; hệ vi sinh của những đối tƣợng béo phì có số lƣợng Firmicutes lớn hơn và ít Bacteroidetes hơn, cũng nhƣ tính đa dạng vi khuẩn tổng số bị giảm [2]. Sự thay đổi các gen của vi khuẩn tiêu biểu đƣợc coi là nguyên nhân ảnh hƣởng đến các con đƣờng chuyển hóa trong cơ thể [3].

Trong số các vi khuẩn lactic có ảnh hƣởng lớn đến trao đổi chất ở ngƣời béo phì, thì chi Lactobacillus giữ một vai trò quan trọng. Lactobacillus là vi khuẩn lactic do sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate là axit lactic. Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Vi khuẩn này có vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và 4 luan an các hội chứng sau khi dùng kháng sinh.

Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5]. Chi Lactobacillus đã đƣợc tìm thấy đa dạng về loài và số lƣợng trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời, nơi có pH axit và số lƣợng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp. Sản xuất enzyme thủy phân muối mật- BSH có thể là một cơ chế đề kháng mật thông thƣờng của chi vi khuẩn này [6].