Luận án tiến sĩ sinh học: Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Huỳnh Thị Phương Liên 2. Đinh Duy Kháng Hà Nội, 2022 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới: Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm nghiên cứu sinh tại Viện. Tôi xin trân trọng cảm ơn tới các thầy cô, anh chị Cơ sở đào tạo là Viện Công nghệ sinh học và Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm nghiên cứu sinh tại Viện.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, TS. Đoàn Hữu Thiển đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu và tham gia khóa đào tạo này; Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. Huỳnh Thị Phương Liên, PGS. Đinh Duy Kháng, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và viết luận án; Tôi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp tại Khoa Kiểm định vắc xin Vi rút, Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tạo điều kiện hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập; Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình tôi, nơi đã cho tôi thêm sức mạnh vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Lý i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực. Các số liệu này chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào khác Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Lý ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.i LỜI CAM ĐOAN.ii MỤC LỤC.iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.vi DANH MỤC CÁC BẢNG.viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU.

Vi rút Viêm não Nhật Bản. Đặc điểm cấu trúc. Kháng nguyên và các yếu tố độc lực của vi rút. Sự nhân lên của vi rút trên tế bào.

Dịch tễ học phân tử của vi rút Viêm não Nhật Bản. Vắc xin Viêm não Nhật Bản. Lịch sử phát triển vắc xin VNNB. Sự phát triển của vắc xin Viêm não Nhật Bản trên tế bào.

Các biến thể di truyền và kháng nguyên trong vi rút VNNB và việc tiêm phòng[34]. Đánh giá chất lượng an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin. Chủng vi rút sản xuất vắc xin Viên não Nhật Bản. Chủng vi rút Nakayama-NIH.

Chủng vi rút Beijing-1. Dòng tế bào nuôi cấy (nhân) vi rút. Các khuyến cáo của TCYTTG cho sản xuất và kiểm định chủng sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt[22]. Yêu cầu chung trong sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt.

Yêu cầu đối với nguồn nguyên liệu đầu vào:. Tóm tắt quy trình thiết lập ngân hàng chủng (Beijing-1) để sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam.31 iii CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Sinh phẩm, hóa chất, thiết bị. Động vật thí nghiệm. Thiết kế nghiên cứu. Biến số và nội dung nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5). Kiểm định vi rút ngoại lai. Kiểm định vô khuẩn. Đánh giá ổn định di truyền.

Hiệu giá vi rút. Thử nghiệm công hiệu của vắc xin. An toàn chung. An toàn đặc hiệu.

Chất gây sốt. Hàm lượng Thimerosal. Hàm lượng Formaldehyde. Hàm lượng DNA tồn dư.

Hàm lượng protein tổng số. Xử lý và phân tích số liệu.53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Kết quả nghiên cứu. Tính ổn định về hiệu giá và di truyền của chủng Beijing-1.

Tính an toàn và sinh miễn dịch bảo vệ của chủng trên các lô vắc xin thành phẩm sản xuất từ chủng BV-WSV-0310 ở quy mô phòng thí nghiệm. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam. Tính ổn định về hiệu giá, di truyền của chủng vi rút Viêm não Nhật Bản sau sản xuất và điều kiện bảo quản. Sự tương đồng kháng nguyên của chủng sản xuất vắc xin VNNB so với các chủng Viêm não Nhật bản lưu hành tại Việt Nam.

Tính an toàn và tính sinh miễn dịch của JECEVAX sản xuất từ chủng BV- WSV-0310 ở quy mô phòng thí nghiệm. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của chủng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero (JECEVAX).93 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.105 TÀI LIỆU THAM KHẢO.106 PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AE Adverse events (biến cố bất lợi) BYT Bộ Y tế BHK-21 Baby Hamster Kidney – 21 (Tế bào thận chuột Hamter sơ sinh) BR209 Beijing reference (Vắc xin mẫu chuẩn Beijing-1) CF Complement Fixation (Cố định bổ thể) CPE Cytopathic effect (hiệu quả gây độc/hủy hoại trên tế bào) CV Challenge virus (vi rút thử thách) E Envelope protein (Protein vỏ) FTM Fluid Thioglycollate Medium (môi trường nuôi cấy vi khuẩn) HA Haemagglutinin Assay (thử nghiệm ngưng kết hồng cầu) HI Haemagglutinin inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu) HT Huyết thanh HLKN Hàm lượng kháng nguyên HGKTTH Hiệu giá kháng thể trung hòa IC51 Vắc xin VNNB trên tế bào vero của Intercell – Áo JEVAX Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột tại Việt Nam JECEVAX Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên tế bào vero tại Việt Nam JE-MB Vắc xin VNNB sản xuất trên não chuột của Nhật Bản KT Kháng thể MRC5 Tế bào phôi phổi bào thai người NICVB Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm Y tế (National Institute for Control of Vaccines and Biologicals). NS Non structural Protein (Protein không cấu trúc) NSX Nhà sản xuất vi NT Neutralization test (thử nghiệm trung hòa) PHK Primary Hamster kidney (thận chuột Hamster tiên phát) PreM Premium membrane (Protein tiền màng) PRNT50 Plaque reduction neutralization test (Trung hòa giảm 50% đám hoại tử) TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TCYTTG/WHO Word Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) THGĐHT Trung hòa giảm đám hoại tử TNLS Thử nghiệm lâm sàng TNMD Thử nghiệm miễn dịch VNNB Viêm não Nhật Bản VABIOTECH Công ty TNHH MTV vắc xin và sinh phẩm số 1 VERO Verda Reno (Tế bào thường trực thận khỉ xanh châu Phi) VX Vắc xin vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Các loại vắc xin VNNB và công nghệ sản xuất hiện nay.

Tỷ lệ mắc VNNB ở bệnh nhân VNVR năm 1991-2019. Cỡ mẫu sử dụng trong nghiên cứu. Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu. Môi trường, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.

Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu. Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu. Chỉ tiêu nghiên cứu trên lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô chủng sản xuất BV-WSV-0310. Chỉ tiêu nghiên cứu trên vắc xin JECEVAX.

Thông tin về trình tự vùng gen E của các chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau sử dụng trong nghiên cứu. Kết quả nhận dạng của chủng gốc và chủng sản xuất bằng phương pháp ELISA. Kết quả kiểm tra LD50 trên não chuột Swiss của chủng gốc BV- MSV-0210. Kết quả kiểm tra LD50trên não chuột Swiss của chủng sản xuất BV- WSV-0310.

Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210bằng thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 bằng thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21. Tỷ lệ tương đồng về nucleotide và protein gen mã hóa kháng nguyên E của chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) so với trình tự vùng gen E của các chủng virút VNNB phân lập ở Việt Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau. Vị trí các epitope và vị trí của các axit amin quyết định tính kháng nguyên thuộc epitope protein E của chủng sản xuất (BV-WSV-0310), chủng tham chiếu (Beijing-1 Kanonji), chủng vi rút VNNB phân lập ở người năm 2014 và chủng vắc xin SA14-14-2.

Tính ổn định hiệu giá chủng gốcBV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV- WSV-0310 khi bảo quản trong nitrogen lỏng. Hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 khi bảo quản ở -20oC. Hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 khi bảo quản ở 2-8oC. Kết quả thử nghiệm vô trùng.

Kết quả kiểm tra Mycoplasma chủng gốc và chủng sản xuất. Kết quả kiểm tra vi rút ngoại lai trên động vật thử nghiệm của chủng gốc và chủng sản xuất. Kết quả kiểm tra vi rút ngoại lai trên tế bào của chủng gốc và chủng sản xuất 66 Bảng 3. Kết quả kiểm tra an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang thí nghiệm của 10 lô vắc xin JECEVAX.

Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của 10 lô vắc xin JECEVAX. Kết quả đánh giá cảm quan, tỷ trọng và vô trùng của 10 lô vắc xin JECEVAX. Kết quả kiểm định các chỉ số hóa học của 10 lô vắc xin JECEVAX. Kết quả đánh giá tính sinh miễn dịch (công hiệu/hiệu giá kháng thể trung hòa (HGKTTH)) của các lô vắc xin JECEVAX trên động vật thực nghiệm.

Kết quả nghiên cứu tiêu chuẩn chất lượng của chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam. Xây dựng tiêu chuẩn về số đời cấy chuyển, tế bào cấy chuyển và nhiệt độ bảo quản chủng gốc và chủng sản xuất. Xây dựng tiêu chuẩn về tính ổn định di truyền và hiệu giá vi rút chủng gốc và chủng sản xuất.74 ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. Cấu trúc bộ gen của vi rút VNNB.

Các tác nhân gây sốt. Một số vắc xin VNNB sản xuất từ chủng Beijing-1. Hình ảnh 1 số vắc xin VNNB sản xuất từ chủng SA14-14-2. Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất từ chủng 821564-XY.

Sơ đồ thiết lập ngân hàng chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310).