Tổng quan nghiên cứu

Thống kê từ Hệ thống cảnh báo nhanh về Thực phẩm và Thức ăn chăn nuôi của Châu Âu (RASFF) cho thấy hơn 5 hợp chất thuộc nhóm alkenylbenzen tự nhiên trong thực vật đang được xếp vào danh mục mối nguy sinh học và hóa học đáng lo ngại. Trong số đó, estragol, methyl eugenol và safrol là các hợp chất thơm dễ bay hơi phổ biến trong các loại gia vị truyền thống như đại hồi, vỏ quế, hạt tiêu, húng quế và thì là. Tuy nhiên, các bằng chứng độc học hiện đại đã chứng minh những hợp chất này có khả năng chuyển hóa sinh học thành các dẫn xuất gây độc gen và hình thành khối u ung thư gan trên động vật thực nghiệm.

Quy định Châu Âu (EC) số 1334/2008 đã cấm hoàn toàn việc chủ động bổ sung 3 chất này vào thực phẩm, đồng thời áp đặt ngưỡng hàm lượng xuất hiện tự nhiên tối đa nghiêm ngặt từ 1 mg/kg đến 60 mg/kg tùy thuộc vào nhóm sản phẩm. Tại Việt Nam, thói quen sử dụng gia vị thảo mộc tự nhiên rất phổ biến, song các dữ liệu phân tích định lượng đồng thời nhóm alkenylbenzen trong thực phẩm vẫn còn khoảng trống lớn.

Nghiên cứu được thực hiện với 2 mục tiêu trọng tâm: Thứ nhất, xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng thời estragol, methyl eugenol và safrol trên cả nền mẫu gia vị khô và gia vị tươi bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ phân giải cao (GC-HRMS). Thứ hai, ứng dụng phương pháp để sàng lọc và định lượng chính xác hàm lượng 3 chất trên trong 90 mẫu gia vị thu thập trên địa bàn Hà Nội trong năm 2024. Đề tài mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi thiết lập phương pháp kiểm nghiệm đạt chuẩn quốc tế với giới hạn định lượng xuống tới 0,02 mg/kg và độ thu hồi từ 80% đến 110%, cung cấp công cụ khoa học chuẩn xác phục vụ đánh giá rủi ro an toàn thực phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu ứng dụng lý thuyết chuyển hóa độc chất học và cơ chế sinh ung thư của các dẫn xuất allylbenzen và propenylbenzen. Khi hấp thu ở liều lượng thấp dưới 10 mg/kg thể trọng, các hợp chất này chuyển hóa an toàn qua con đường khử methyl liên hợp glucuronic hoặc glutathiol. Tuy nhiên, khi hấp thu lượng lớn, con đường chuyển hóa bão hòa sẽ kích hoạt phản ứng 1'-hydroxyl hóa tại gan, tạo thành các carbocation kém bền có khả năng liên kết cộng hóa trị trực tiếp với ADN và protein, gây đột biến gen.

Cơ sở pháp lý và độc học của đề tài dựa trên khung phân loại của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), trong đó xếp methyl eugenol vào nhóm 2A và safrol vào nhóm 2B. Đồng thời, nghiên cứu tích hợp nguyên lý đánh giá an toàn phụ gia thực phẩm theo hướng dẫn của Ủy ban Chuyên gia FAO/WHO (JECFA) và các quy chuẩn kiểm soát dư lượng theo tiêu chuẩn Châu Âu EC 1334/2008. Bốn khái niệm cốt lõi được vận hành xuyên suốt gồm: điểm nhận dạng phổ khối (IP), tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu nền (S/N), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thực hiện thu thập ngẫu nhiên 90 mẫu gia vị tươi và khô tại các chợ truyền thống và siêu thị trên địa bàn Hà Nội. Cỡ mẫu bao gồm 15 mẫu hạt tiêu, 13 mẫu quế, 18 mẫu đại hồi, 5 mẫu bột tiêu, 7 mẫu bột quế, 2 mẫu bột hồi cùng nhiều loại rau thơm tươi như 6 mẫu húng bạc hà, 4 mẫu húng quế, 5 mẫu thì là, 3 mẫu húng chanh, 2 mẫu rau mùi, đinh hương, gừng, giềng, hạt dổi và mắc khén. Phương pháp chọn mẫu phân tầng ngẫu nhiên giúp đại diện đầy đủ cho các nhóm gia vị có tinh dầu phổ biến tại Việt Nam.

Lý do lựa chọn kỹ thuật phân tích GC-HRMS (hệ thống sắc ký khí Trace GC 1300 kết hợp đầu dò khối phổ Orbitrap Q-Exactive) là vì các alkenylbenzen có cấu trúc hóa học phân tử nhỏ, độ bay hơi cao và nhiều đồng phân vị trí. Đầu dò Orbitrap cung cấp độ phân giải khối lượng cực cao với sai số khối không quá 5 ppm ở chế độ quét toàn dải Full scan m/z từ 50 đến 700 Da, đảm bảo loại bỏ hoàn toàn hiện tượng dương tính giả từ ma trận nền gia vị phức tạp.

Về kỹ thuật xử lý mẫu, phương pháp chiết rung siêu âm (UAE) bằng dung môi Ethyl acetat (AcOEt) ở nhiệt độ phòng trong 45 phút được lựa chọn thay vì phương pháp QuEChERS hay chiết nhiệt độ cao. Kỹ thuật này giúp bảo vệ tối đa các hợp chất kém bền nhiệt như methyl eugenol, giảm thiểu bay hơi và nâng cao hiệu suất chiết. Quá trình thẩm định phương pháp được hoàn thành toàn diện trong năm 2024, tuân thủ nghiêm ngặt theo các tiêu chí xác nhận giá trị sử dụng của Hiệp hội Phân tích Chính thức (AOAC) và Hướng dẫn EU 2021/808.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công chương trình nhiệt độ sắc ký khí bắt đầu từ 50°C giữ trong 3 phút, tăng dần tốc độ nhiệt lên 280°C trên cột phân tích TG-35MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Điều kiện này tách sắc nét hoàn toàn 3 chất phân tích và các chất đối chứng với thời gian lưu chuẩn xác: estragol đạt 11,33 phút, safrol đạt 12,71 phút, methyl eugenol đạt 14,03 phút, chất đồng hành dicyclohexylmethanol đạt 15,91 phút và nội chuẩn cafein đạt 17,04 phút.

Thứ hai, phương pháp chiết siêu âm bằng AcOEt trong 45 phút ở nhiệt độ phòng mang lại hiệu suất thu hồi vượt bậc, dao động từ 85,4% đến 104,2% trên cả hai nền mẫu tiêu đen và húng bạc hà. So với kỹ thuật QuEChERS chỉ đạt hiệu suất thu hồi từ 45% đến 65% trên mẫu gia vị tươi, phương pháp UAE với AcOEt đã cải thiện độ thu hồi lên hơn 30%.

Thứ ba, quá trình thẩm định khẳng định phương pháp đạt độ tin cậy vượt trội: độ tuyến tính tuyệt vời với hệ số tương quan R2 > 0,999 trong dải nồng độ từ 0,02 đến 5,0 mg/L; giới hạn định lượng LOQ đạt 0,02 mg/kg; độ lặp lại có hệ số biến thiên RSD luôn nhỏ hơn 6,5%; độ lệch khối phổ thực nghiệm so với lý thuyết đều dưới 2,7 ppm, mang lại điểm nhận dạng IP đạt 5,5 điểm.

Thứ tư, kết quả sàng lọc và định lượng trên 90 mẫu thực tế ghi nhận tỷ lệ phát hiện alkenylbenzen rất cao. Đáng chú ý, estragol xuất hiện với hàm lượng lớn trong các mẫu đại hồi và húng quế, trong khi methyl eugenol và safrol được tìm thấy phổ biến trong các mẫu vỏ quế, hạt tiêu và hạt dổi ở các mức nồng độ biến thiên từ vài mg/kg đến hàng nghìn mg/kg.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất chiết xuất vượt trội của Ethyl acetat bắt nguồn từ độ phân cực trung bình tương thích tối ưu với khung carbon thơm kỵ nước của alkenylbenzen. Việc duy trì chiết xuất ở nhiệt độ phòng trong 45 phút giúp hạn chế triệt để sự thất thoát do bay hơi và ngăn chặn phản ứng nhiệt phân hủy vốn rất nhạy cảm ở các hợp chất nhóm phenylpropanoid.

Khi so sánh với các công bố quốc tế của các nhóm nghiên cứu tại Châu Âu sử dụng kỹ thuật GC-HRMS trên nền mẫu hồ tiêu khô, phương pháp trong luận văn này thể hiện tính ưu việt rõ nét khi áp dụng đồng thời và hiệu quả trên cả các nền mẫu gia vị tươi chứa hàm lượng nước và diệp lục cao như rau húng và thì là.

Dữ liệu định lượng thu được có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua các biểu đồ phân bố cột biểu diễn tổng nồng độ tích lũy 3 độc chất theo từng họ thực vật, kết hợp bảng thống kê tỷ lệ phát hiện trên 90 mẫu. Điều này làm nổi bật sự khác biệt về hàm lượng độc tố tự nhiên giữa nhóm tinh dầu vỏ thân gỗ, quả hạt khô và mô lá tươi, cung cấp bằng chứng rõ ràng về nguy cơ tích lũy độc chất qua khẩu phần ăn hàng ngày.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Ban hành quy chuẩn kỹ thuật: Bộ Y tế cùng Cục An toàn Thực phẩm cần sớm xây dựng và ban hành Quy chuẩn Kỹ thuật Quốc gia (QCVN) quy định ngưỡng giới hạn tối đa cho phép đối với estragol, methyl eugenol và safrol trong gia vị chế biến sẵn, tiệm cận với tiêu chuẩn Châu Âu EC 1334/2008 (từ 10 mg/kg đến 50 mg/kg) trước năm 2026.
  2. Tiêu chuẩn hóa quy trình phân tích: Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia chủ trì chuyển giao quy trình phân tích GC-HRMS với LOQ đạt 0,02 mg/kg và độ thu hồi trên 80% tới ít nhất 15 trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm và thực phẩm tuyến tỉnh trong giai đoạn 2025 - 2027.
  3. Tăng cường thanh tra và giám sát: Các cơ quan quản lý thị trường và an toàn thực phẩm cần định kỳ lấy mẫu kiểm tra độc lập đối với 100% các cơ sở chế biến gia vị đóng gói công nghiệp quy mô lớn, hướng đến mục tiêu giảm thiểu 30% nguy cơ phơi nhiễm độc chất alkenylbenzen trong thực phẩm thương mại vào năm 2028.
  4. Xây dựng hướng dẫn sử dụng an toàn: Hiệp hội Gia vị Việt Nam phối hợp cùng các viện nghiên cứu phát hành tài liệu khuyến cáo cộng đồng về liều lượng tiêu thụ hợp lý đối với các loại tinh dầu gia vị đậm đặc, hạt hồi và vỏ quế, ngăn ngừa nguy cơ vượt ngưỡng hấp thu an toàn hàng ngày (ADI) ở người tiêu dùng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Chuyên viên kiểm nghiệm và phân tích hóa dược: Tiếp cận trực tiếp quy trình xử lý mẫu siêu âm AcOEt tinh gọn và các thông số cài đặt GC-HRMS Orbitrap tối ưu để ứng dụng định lượng độc chất với sai số khối dưới 5 ppm.
  2. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm: Sử dụng bộ dữ liệu thực tế từ 90 mẫu gia vị làm căn cứ khoa học xác thực để hoạch định chính sách, xây dựng danh mục kiểm soát và thiết lập mức giới hạn phơi nhiễm độc tố.
  3. Doanh nghiệp sản xuất và xuất khẩu gia vị: Áp dụng phương pháp phân tích để kiểm soát chất lượng nguyên liệu hạt tiêu, hồi, quế, đảm bảo các chỉ tiêu an toàn hóa học đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe của thị trường EU và Hoa Kỳ.
  4. Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học: Sử dụng làm tài liệu tham khảo mẫu mực về quy trình thẩm định phương pháp phân tích theo chuẩn AOAC và kỹ thuật khối phổ phân giải cao trong kiểm nghiệm thuốc và độc chất.

Câu hỏi thường gặp

  1. Alkenylbenzen là gì và tại sao chúng lại gây lo ngại về an toàn thực phẩm? Alkenylbenzen là nhóm hợp chất thơm tự nhiên như estragol, methyl eugenol và safrol có nhiều trong gia vị. Khi tiêu thụ quá mức, các chất này chuyển hóa qua con đường 1'-hydroxyl hóa tạo thành carbocation liên kết với ADN, gây đột biến gen và làm tăng nguy cơ ung thư gan theo đánh giá của IARC nhóm 2A và 2B.

  2. Kỹ thuật chiết siêu âm với Ethyl acetat có ưu điểm gì so với QuEChERS? Phương pháp chiết siêu âm với AcOEt ở nhiệt độ phòng trong 45 phút cho hiệu suất thu hồi cao vượt trội từ 85,4% đến 104,2%, cao hơn QuEChERS từ 30% đến 40% trên mẫu tươi. Quy trình này thao tác nhanh, ít dung môi, ngăn ngừa tối đa sự phân hủy nhiệt và bay hơi của độc chất.

  3. Điểm vượt trội của hệ thống GC-HRMS Orbitrap trong nghiên cứu này là gì? Hệ thống GC-HRMS Orbitrap cung cấp độ phân giải khối rất cao với sai số khối dưới 2,7 ppm, quét dải khối rộng từ 50 đến 700 Da. Thiết bị đáp ứng trọn vẹn 5,5 điểm nhận dạng (IP) theo tiêu chuẩn EU 2021/808, giúp định danh chính xác các đồng phân mà không bị nhiễu nền từ gia vị.

  4. Tiêu chuẩn Châu Âu EC 1334/2008 quy định giới hạn các hợp chất này như thế nào? Quy định Châu Âu EC 1334/2008 cấm hoàn toàn việc thêm estragol, methyl eugenol và safrol dạng tinh khiết vào thực phẩm. Đối với hàm lượng tự nhiên, quy định áp mức giới hạn nghiêm ngặt từ 1 mg/kg trong đồ uống không cồn đến 50 - 60 mg/kg trong các sản phẩm thịt, cá và nước sốt.

  5. Độ nhạy và phạm vi khảo sát của nghiên cứu đạt mức nào? Nghiên cứu đã khảo sát thành công 90 mẫu gia vị tươi và khô thu thập ngẫu nhiên tại Hà Nội. Phương pháp đạt độ nhạy vượt trội với giới hạn định lượng LOQ chỉ 0,02 mg/kg và đường chuẩn tuyến tính đạt hệ số tương quan R2 > 0,999 trong khoảng nồng độ từ 0,02 đến 5,0 mg/L.

Kết luận

  • Xây dựng thành công quy trình chiết siêu âm bằng Ethyl acetat ở nhiệt độ phòng trong 45 phút, xử lý hiệu quả cả nền mẫu gia vị tươi và gia vị khô.
  • Thẩm định hoàn chỉnh phương pháp GC-HRMS Orbitrap đạt độ nhạy cực cao với LOQ là 0,02 mg/kg, độ thu hồi đạt từ 85,4% đến 104,2% và sai số khối phổ dưới 2,7 ppm.
  • Đánh giá toàn diện hàm lượng estragol, methyl eugenol và safrol trên 90 mẫu gia vị thực tế tại Hà Nội, phát hiện tỷ lệ xuất hiện đáng kể trong đại hồi, quế, tiêu và húng quế.
  • Cung cấp phương pháp phân tích tiên tiến đạt chuẩn AOAC và EU 2021/808, tạo cơ sở dữ liệu thực chứng cho việc kiểm soát an toàn thực phẩm tại Việt Nam.
  • Thiết lập kế hoạch mở rộng nghiên cứu định lượng trên 500 mẫu thực phẩm chế biến sẵn và đồ uống chứa hương liệu trong giai đoạn 2025 - 2026.

Các phòng kiểm nghiệm, cơ quan quản lý và doanh nghiệp chế biến thực phẩm hãy chủ động áp dụng quy trình phân tích GC-HRMS này để nâng cao năng lực giám sát độc chất và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.