Khóa luận Dược sĩ: Khảo sát tách chiết protease tụy lợn bằng 2 pha lỏng ATPS

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI MINH NAM KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT PROTEASE TỪ TỤY LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT 2 PHA LỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2024 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI MINH NAM Mã sinh viên: 1901460 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT PROTEASE TỪ TỤY LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT 2 PHA LỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. Mai Văn Hiên Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa Sinh HÀ NỘI – 2024 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin được gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo của Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã luôn tâm huyết giảng dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian năm năm học tập và rèn luyện tại trường. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Hóa Sinh – khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập, nghiên cứu.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Ths. Mai Văn Hiên, là người giảng viên hướng dẫn đầy nhiệt huyết, đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình bổ sung cho em những kiến thức chuyên môn cần thiết và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tại bộ môn Hóa Sinh - Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội. Em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đào Thị Mai Anh, Ths.

Vũ Thị Phượng, giảng viên tại bộ môn Hóa Sinh đã sẵn sàng giúp đỡ, đưa cho em những lời khuyên về chuyên môn và kinh nghiệm quý báu để hoàn thành tốt khóa luận. Thêm vào đó, sự đồng hành của em Thu, em Trâm Anh, em Quỳnh và toàn thể nhóm nghiên cứu enzym là sự động viên vô cùng to lớn đối với em. Cảm ơn các em đã luôn sẵn sàng giúp đỡ để em có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất. Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ, người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em trên con đường học tập và rèn luyện bản thân.

Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 1 tháng 6 năm 2024 Sinh viên Bùi Minh Nam MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ. Vi sinh vật. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT PROTEASE. Phương pháp kết tủa.

Phương pháp tách chiết hai pha lỏng. Hệ thống Polyme/Muối. Hệ thống Polyme/Polyme. PROTEASE TUYẾN TỤY.

Cấu trúc và tính chất. Cơ chế hoạt hóa và xúc tác của enzym. Ứng dụng trong y dược học. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác.

Tình hình nghiên cứu tách chiết protease từ tuyến tụy. Trên thế giới. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ.

Thiết bị thí nghiệm. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Chiết tách protease từ tụy lợn.

Chiết lấy dịch tụy đồng nhất. Tách chiết bằng phương pháp kết tủa. Tách chiết bằng ATPS. Xác định hoạt tính enzym protease.

Xác định hàm lượng protein. Điện di SDS-PAGE. Xử lý số liệu. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.

Đánh giá hiệu quả tách chiết của ATPS. Chiết lấy dịch tụy đồng nhất. Tách chiết protease qua một bước kết tủa. Tách chiết protease qua hai bước kết tủa và ATPS.

Tách chiết protease qua một bước ATPS. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả tách chiết bằng ATPS. Thay đổi các thành phần của ATPS. Thay đổi tỷ lệ các thành phần của ATPS.

Thay đổi pH của ATPS. Về kết quả đánh giá hiệu quả tách chiết của ATPS. Về kết quả tách chiết protease qua một bước kết tủa. Về kết quả tách chiết protease qua hai bước kết tủa và ATPS.

Về kết quả tách chiết protease qua một bước ATPS. Về kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình tách chiết bằng ATPS. Về kết quả đánh giá ảnh hưởng của thành phần hai pha. Về kết quả đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ hai pha.

Về kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt APS Ammonium persulphate ATPS Aqueous two-phase system Hệ thống hai pha lỏng BE Back extraction Chiết ngược Bis-acrylamid N, N’-Methylen-bis-acrylamid BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò EC The Enzym Commission Tiểu ban enzym FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ IL Ionic liquid Chất lỏng ion kDa Kilo Dalton mg pr Miligram protein NaPA Natri polyacrylat PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis PEG Polyethylene glycol SDS Sodium dodecyl sulfat TCA Tricloacetic acid TEMED N,N,N’,N’- Tetramethylethylenediamin TTP Three-phase partitioning Phân vùng ba pha Tris Tris –(hydroxymethyl)-aminomethan w/v Weight/Volume Khối lượng/Thể tích w/w Weight/weight Khối lượng/khối lượng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Đặc điểm của một số loại endopeptidase. Một số nghiên cứu tách chiết protease bằng ATPS.

Tính chất hóa lý của protease tụy. Một số nghiên cứu tách chiết protease từ tuyến tụy. Các hóa chất sử dụng. Thành phần các loại đệm và dung dịch.

Các thiết bị sử dụng. Thành phần gel tách và gel gom trong điện di SDS-PAGE. Kết quả tách chiết protease qua một bước kết tủa. Kết quả tách chiết enzym qua hai bước kết tủa và ATPS.

Kết quả tách chiết enzym qua một bước ATPS. Kết quả tách chiết enzym bằng ATPS từ dịch tụy ban đầu và dịch enzym thô sau kết tủa. Kết quả tách chiết enzym với hệ PEG6000/Natri citrat với các tỷ lệ hai pha khác nhau. Kết quả tách chiết enzym với hệ PEG6000/Natri citrat với các pH khác nhau .31 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.

Mô hình cấu trúc hai thùng beta của trypsin. Tính đặc hiệu của túi S1 của trypsin, chymotrypsin và elastase. Sơ đồ thể hiện quá trình hoạt hóa trypsin bởi enterokinase. Sơ đồ thể hiện quá trình hoạt hóa tiền enzym các protease tụy.

Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu. Quy trình tách chiết protease từ tụy lợn. Đường chuẩn Tyrosin. Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn.

Điện di đồ quá trình tách chiết protease từ tụy lợn bằng SDS-PAGE. Độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng các ATPS khác nhau từ dịch enzym sau kết tủa (A) và dịch tụy ban đầu (B). Sự thay đổi của độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng hệ PEG6000/Natri citrat theo tỷ lệ hai pha. Sự thay đổi của độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi hoạt tính khi tách chiết enzym bằng hệ PEG6000/Natri citrat theo pH .31 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong bối cảnh toàn cầu hóa và phát triển bền vững hiện nay, việc khai thác và sử dụng hiệu quả các nguồn tài nguyên sẵn có, đặc biệt là các phụ phẩm và phế phẩm từ các ngành công nghiệp khác nhau, đang trở thành một vấn đề cấp bách.

Không chỉ góp phần giảm thiểu tác động đến môi trường, việc tận dụng các phụ phẩm và phế phẩm còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế, đồng thời thúc đẩy sự phát triển của nền kinh tế tuần hoàn bền vững. Trong lĩnh vực chăn nuôi, ngành công nghiệp chế biến thịt lợn là một trong những ngành sản xuất ra nhiều phụ phẩm và phế phẩm nhất như tụy, ruột, da, xương,… Trong đó, tụy lợn là một nguồn phụ phẩm giàu tiềm năng vì chứa một lượng lớn enzym protease [20], [28], [82]. Protease là enzym đóng vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp khác nhau, chiếm 60% thị trường enzym. Chúng được sử dụng trong sản xuất chất tẩy rửa, da, thực phẩm, dược phẩm, giấy và bột giấy, cũng như trong việc thu hồi bạc từ phim ảnh và các quy trình xử lý sinh học [40].

Đặc biệt trong ngành y dược học, protease vừa có thể là nguyên liệu thô để tổng hợp các chế phẩm dược dụng, vừa đóng vai trò như một công cụ để sản xuất ra các loại thuốc khác [40], [95]. Nhờ những ứng dụng của mình, thị trường protease dự kiến sẽ tăng trưởng đáng kể trong những năm tới, có thể đạt 3,54 tỷ đô la trong năm 2024 và dự kiến đạt 4,72 tỷ đô la vào năm 2029 [46]. Đây là lý do thôi thúc các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu về các nguồn tổng hợp, các phương pháp làm tăng hiệu suất, độ tinh sạch của protease. Trong khi đó phương pháp tách chiết 2 pha lỏng gần đây được quan tâm để thay thế các phương pháp truyền thống trong chiết xuất enzym nhờ sở hữu nhiều ưu điểm như hiệu suất cao, chi phí thấp, thân thiện với môi trường và dễ dàng mở rộng quy mô [62], [63].

Tuy nhiên, hiệu suất tách chiết phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần, tỷ lệ pha lỏng, pH, nhiệt độ, thời gian và các điều kiện khác [48], [77]. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Khảo sát một số điều kiện tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng” được thực hiện với 2 mục tiêu chính: 1. Đánh giá hiệu quả tách chiết protease từ tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả tách chiết protease tụy lợn bằng phương pháp tách chiết 2 pha lỏng.

Định nghĩa Protease hay enzym thủy phân protein, peptidase, proteinase được định nghĩa là các enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid [17]. Theo Ủy ban Danh pháp của Liên minh Hóa sinh và Sinh học Phân tử Quốc tế (IUBMB), protease được xếp vào lớp 3 – Hydrolase và là phân lớp 4 (EC 3. Phân loại Việc phân nhóm các protease có thể dựa trên loại phản ứng trong đó protease đóng vai trò là chất xúc tác hay bản chất và tính chất hóa học của vị trí xúc tác, cũng như sự phát triển của cấu trúc protease và mối quan hệ của chúng [39]. Việc phân loại protease dựa trên tính đặc hiệu hoặc cơ chế xúc tác của chúng đã được Agarwal thảo luận [6].

Trong nghiên cứu này, dựa trên loại phản ứng, enzym protease được chia thành Exopeptidase (EC 3.19) và Endopeptidase (EC 3. Exopeptidase Exopeptidase hoạt động ở cuối hoặc gần cuối chuỗi polypeptid và được phân loại thành aminopeptidase hoặc carboxypeptidase. Exopeptidase giải phóng acid amin đầu N được gọi là aminopeptidase. Những chất xúc tác phản ứng giải phóng dipeptid hoặc tripeptid lần lượt được gọi là dipeptidylpeptidase hoặc tripeptidylpeptidase [17], [73].