Luận án: Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật ở lúa khoai trên đất phèn vùng đồng bằng sông Cửu Long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP LÝ NGỌC THANH XUÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN LIÊN KẾT VỚI THỰC VẬT (PLANT ASSOCIATED BACTERIA) Ở LÚA, KHOAI TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÈN VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT Mã số: 9620103 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP LÝ NGỌC THANH XUÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN LIÊN KẾT VỚI THỰC VẬT (PLANT ASSOCIATED BACTERIA) Ở LÚA, KHOAI TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÈN VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT Mã số: 9620103 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. TRẦN VĂN DŨNG GS. NGÔ NGỌC HƯNG 2019 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn đến Em Lâm Tiên Nga, em Nguyễn Như Thanh, em Trần Lê Kim Trí, em Lê Thị Thúy Loan, em Nguyễn Thị Xuân Mỵ và anh Trần Văn Bé Năm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Quí Thầy, Cô và các Anh, Chị, Em trong Bộ môn Khoa học đất - Khoa Nông nghiệp đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm thực tiễn hết sức quý báu và luôn quan tâm, hỗ trợ tôi trong việc hoàn thành luận án.

Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Khoa Sau Đại học và các Phòng ban của Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường. Ban Giám hiệu Trường Đại học An Giang, Lãnh đạo Phòng Quản Trị - Thiết bị, các bạn đồng nghiệp thuộc Khu Thí nghiệm - Thực hành đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứ sinh. Đặc biệt xin gởi lời chân thành cảm ơn sâu sắc đến GS. TS Ngô Ngọc Hưng, PGS.

Trần Văn Dũng, GS. TS Cao Ngọc Điệp và PGS. Nguyễn Hữu Hiệp đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, cung cấp nhiều kiến thức quý báu trong suốt quá trình tôi học tập. Từ đó, giúp tôi lĩnh hội thêm nhiều kiến thức mới trong lĩnh vực nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận án tốt nghiệp.

Em Nguyễn Quốc Khương, em Lương Thị Hoàng Dung, em Lê Văn Dang, em Lê Phước Toàn, em Trần Ngọc Hữu và em Nguyễn Thị Xuân Đào đã tận tình giúp đỡ, chia sẽ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Cha mẹ hai bên và gia đình nhỏ của tôi luôn là nguồn động viên, là chỗ dựa tinh thần, niềm an ủi, ủng hộ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi bày tỏ sự biết ơn sâu sắc với tấm lòng tôn trọng và mãi luôn khắc ghi những công ơn quý báo này. Xin chân thành cảm ơn! Lý Ngọc Thanh Xuân i TÓM TẮT Đất phèn có pH thấp, đã dẫn đến hàm lượng dưỡng chất thấp.

Đề tài “Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (plant associated bacteria) ở lúa, khoai trồng trên đất phèn vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện nhằm mục tiêu (i) Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân hiện diện trong đất và nội sinh trong cây lúa, khoai lang trên đất phèn (ii) Xác định ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân đến sinh trưởng và năng suất lúa và khoai lang. Mẫu đất phèn, khoai lang và lúa được thu thập tại bốn vùng đất phèn Tứ giác Long Xuyên (TGLX), Đồng Tháp Mười (ĐTM), Trũng sông Hậu (TSH) và Bán đảo cà Mau (BĐCM). Bốn trăm ba mươi mốt chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa, trong đó có 272 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 159 chủng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong, vàng nhạt và vàng đậm.

Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, hầu hết các chủng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Bốn trăm hai mươi bốn chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai lang, trong đó có 271 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 153 chủng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, một số lượng nhỏ các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình cầu.

Các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và có khả năng hòa tan lân khó tan. Hai mươi chín chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA. Các chủng vi khuẩn này đa dạng về loài thuộc 3 nhóm vi khuẩn: Bacilli, Gammaproteobacteria và Betaproteobacteria. Mười hai chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai lang mà có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA.

Các dòng vi khuẩn này đa dạng về loài chỉ thuộc 2 nhóm vi khuẩn: Bacilli và Gammaproteobacteria. Kết quả thí nghiệm đồng ruộng cho thấy nghiệm thức không bón đạm đã làm giảm năng suất lúa trên đất phèn, Long Mỹ - Hậu Giang, Hòn Đất - Kiên Giang và Hồng Dân, Bạc Liêu, nhưng nghiệm thức bón 60 kg N ha-1 kết hợp với vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis X1 đã đạt năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O5- 30K2O trên đất phèn Hòn Đất - Kiên Giang. Tương tự, nghiệm thức bổ sung vi khuẩn B. vietnamiensis X3 đã làm tăng năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Long Mỹ - Hậu Giang và Hồng Dân - Bạc Liêu.

Tuy nhiên, nghiệm thức không bón lân chưa thể hiện sự thiếu lân trên ba vùng phèn trên nên chưa đưa đến sự khác biệt về năng suất của sử dụng vi ii khuẩn B. Hoạt tính cố định đạm của vi khuẩn B. acidipaludis X5 mạnh nhất so với 2 vi khuẩn còn lại thông qua việc gia tăng số củ và năng suất củ khoai lang. Bón 60 kg N ha-1 kết hợp với chủng vi khuẩn B.

acidipaludis X5 cho số củ, chiều dài củ, đường kính củ và năng suất củ khoai lang tương đương với bón 90 kg N ha-1. Sử dụng chủng vi khuẩn B. acidipaludis X5 đã tiết kiệm được khoảng 30% lượng phân đạm bón cho khoai lang. Cần áp dụng các dòng này trong cánh tác lúa và khoai lang ở ĐBSCL.

Từ khóa: cố định đạm, đất phèn, hòa tan lân, vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn nội sinh. iii ABSTRACT Acid sulfate soils possess low pH resulting low nuutrients for plants. The study titled “Isolation, selection, characterization and identification of endophytic and rhizospheric bacteria associated with rice and sweet potato from acid sulfate soil in the Mekong delta, Vietnam” was conducted for the following objectives (i) isolation of endophytic and rhizospheric bacterial strains associated with sweet potato and rice for abilities of nitrogen fixing, phosphate-solubilizing; (ii) selection of promising nitrogen fixing, phosphate- solubilizing bacterial strains for improvement of sweet potato and rice growth and yield. The sweet potato and rice plant, and soil samples were collected from four acid sulfate soil areas including Ca Mau Peninsula, Long Xuyen Quadrangle, Depressed area of Hau River and Plain of Reed in the Mekong Delta, Vietnam.

A total of 431 rice endophytic bacterial strains including 272 strains isolated from rhizobacterial strains and 159 endophytic bacterial strains were obtained. Morphological properties of colonies had colorless, opaque, yellow and very yellow. Besides, colony morphology was mainly circular shapes and entire margin, rod shape and Gram-negative. A total of 424 rice endophytic bacterial strains consisting of 271 strains isolated from rhizobacterial strains and 153 endophytic bacterial strains were obtained.

Morphological characteristics of colonies also were transparency, milk-color, yellow and very yellow. Moreover, colony morphology was mostly circular shapes and entire margin, rod shape and Gram-positive, but several strains had sphere shape. The 25 selected rice endophytic bacterial strains had promised high abilities for nitrogen fixing, phosphate-solubilizing that were identified by 16S rDNA sequence analysis. The phylogenetic analysis is belonged to Bacilli, Gammaproteobacteria and Betaproteobacteria groups.

Similarly, The 2 selected sweet potato, yam, and cassava endophytic bacterial strains had high promised capacities for nitrogen fixing, phosphate-solubilizing, which were identified by 16S rDNA sequence analysis. The phylogenetic analysis is closely classified to Bacilli and Gammaproteobacteria groups. The without nitrogen fertilizer application decreased rice yield on acid sulfate soil in Long My - Hau Giang, Hon Dat - Kien Giang and Hong Dan - Bac Lieu, but the application of both 60 kg N ha-1 and Burkholderia vietnamiensis X1 resulted in higher rice yield compared to control treatment (90N-60P2O5-30K2O) on acid sulfate soil in Hon Dat - Kien Giang. Similarly, the applied B.

vietnamiensis X3 increased productivity in Long My - Hau Giang, and Hong Dan - Bac Lieu. However, without phosphorus fertilizer application have not been improved yield by application of B. vietnamiensis iv X3 because there were not significant differences between phosphorus and without phosphorus fertilization. The bacteria Burkholderia acidipaludis X5 have high nitrogen fixation capability compared to those in the 2 other bacteria through increased number of tubers and yield of sweet potato.

Applying kg N ha-1 in combination with incubation of bacteria Burkholderia acidipaludis X5 showed that the tuber number, tuber length, tuber diameter and sweet potato yield were equivalent with applying kg N ha-1. Incubation with bacteria Burkholderia acidipaludis X5 could save 30% of nitrogen fertilizers for sweet potato. The potential bacterial strains should be used in cultivating rice and sweet potato in the Mekong delta. Key words: acid sulfate soil, endophytic bacteria, nitrogen fixing, phosphate- solubilizing, rhizobacterial.

v LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Số liệu trong đề tài nghiên cứu sinh này thuộc đề tài “Nghiên cứu sử dụng hợp lý đất phèn đồng bằng sông Cửu Long thích ứng với biến đổi khí hậu”, với mã số BĐKH57. Cần Thơ, ngày 04 tháng 3 năm 2019 Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh Lý Ngọc Thanh Xuân vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.

iv LỜI CAM ĐOAN. vi MỤC LỤC. vii DANH SÁCH BẢNG. x DANH SÁCH HÌNH.

xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT. xiv CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU.3 Nội dung nghiên cứu.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .5 Những đóng góp mới của luận án .6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án. 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết với thực vật trong nông nghiệp .2 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết thực vật .3 Những tiến bộ trong nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật liên kết với thực vật .2 Đặc điểm thổ nhưỡng các vùng sinh thái đất.1 Phân loại đất phèn .2 Đặc điểm thổ nhưỡng và các trở ngại trên đất phèn ĐBSCL .