Luận án tiến sĩ: Sử dụng thực khuẩn thể phòng trị bệnh thối hạt lúa do Burkholderia glumae - Đoàn Thị Kiều Tiên, ĐH Cần Thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐOÀN THỊ KIỀU TIÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THỰC KHUẨN THỂ TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH THỐI HẠT TRÊN LÚA DO VI KHUẨN Burkholderia glumae LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ 62 62 01 12 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐOÀN THỊ KIỀU TIÊN MÃ SỐ NCS: P0315002 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THỰC KHUẨN THỂ TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH THỐI HẠT TRÊN LÚA DO VI KHUẨN Burkholderia glumae LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ 62 62 01 12 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. NGUYỄN THỊ THU NGA PGS. TRẦN THỊ THU THỦY 2022 LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận án Tiến Sĩ, ngoài sự nỗ lực của bản thân trong quá trình học tập, tôi còn nhận được sự hỗ trợ và giúp đỡ tận tình của quý Thầy, Cô và đồng nghiệp. Xin chân thành, đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.

Nguyễn Thị Thu Nga, người đã hướng dẫn, định hướng, hỗ trợ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Cô đã dành cho tôi nhiều thời gian, tâm sức, cho nhiều ý kiến, nhận xét quý báu để tôi hoàn thành luận án. Trần Thị Thu Thủy, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, góp ý và luôn quan tâm, động viên, nhắc nhở kịp thời để tôi có thể hoàn thiện luận án. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS.

Lê Văn Vàng, PGS. Lê Việt Dũng và GS. Kaeko Kamei đã tạo điều kiện để tôi được tham gia vào dự án JICA, tạo điều kiện cho tôi sang Nhật để học tập nâng cao kiến thực chuyên môn, phục vụ cho nghiên cứu luận án; Chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Khoa sau Đại học, Khoa Nông nghiệp, phòng Đào tạo và các phòng ban chức năng khác của nhà trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn quý Thầy, Cô và các anh, chị đồng nghiệp trong Bộ môn Bảo vệ Thực vật, những người đã giảng dạy và giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập, hướng dẫn các chuyên đề trong chương trình nghiên cứu sinh; Cảm ơn các em sinh viên, những người đã không ngại khó khăn cùng với tôi đi thu mẫu, thực hiện nghiên cứu để hoàn thành luận án; Cuối cùng, xin thành kính biết ơn Ba, Mẹ người đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ tôi nên người.

Cảm ơn chồng và 2 con trai luôn ở bên cạnh, động viên, chia sẻ, giúp tôi có thêm động lực để phấn đấu, vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu luận án. Đoàn Thị Kiều Tiên xv CAM ĐOAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tôi xin cam kết quyển luận án là do bản thân nghiên cứu sinh thực hiện, không do người khác làm thay, các tài liệu tham khảo được nghiên cứu sinh xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng và trích dẫn đầy đủ, kết quả nêu ra trong luận án được hoàn thành dựa trên 01 kết quả nghiên cứu học viên và 06 sinh viên, các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2 TÁC GIẢ LUẬN ÁN NGUYỄN THỊ THU NGA TRẦN THỊ THU THỦY ĐOÀN THỊ KIỀU TIÊN xvi TÓM TẮT Luận án được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm Bệnh cây và nhà lưới thuộc Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, vùng trồng lúa tại tỉnh Vĩnh Long và Viện Kỹ Thuật Kyoto Nhật Bản từ 2015 đến 2019. Luận án “Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae” nhằm tuyển chọn những dòng thực khuẩn thể triển vọng có hiệu quả trong phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn B.

glumae ở điều kiện ngoài đồng, từ đó khẳng định hiệu quả của biện pháp sinh học sử dụng thực khuẩn thể trong quản lý bệnh thối hạt lúa, góp phần giảm lượng thuốc hóa học trong môi trường. Luận án được hoàn thành với các nội dung chính như sau: Nội dung một là phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa. Phân lập được 112 dòng thực khuẩn thể và 60 dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa tại chín tỉnh đồng bằng sông Cửu Long của Việt Nam. Đã chọn được 8 dòng thực khuẩn thể (ФBurTV25a, ФBurDT46, ФBurDT47a, ФBurDT47b, ФBurDT48a, ФBurVL34, ФBurVL39, ФBurAG58) có phổ kí sinh rộng trên nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt (chiếm khoảng 75% trong tổng số vi khuẩn gây bệnh thối hạt), đồng thời cũng chọn 6 dòng vi khuẩn (BurVL21, BurDT46, BurDT50; BurDT51, BurKG52, BurKG57) gây bệnh thối hạt bị nhiều dòng thực khuẩn thể kí sinh (chiếm 55% dòng thực khuẩn thể kí sinh).

Tiếp theo, xác định được 6 dòng vi khuẩn (BurVL21, BurDT46, BurDT50; BurDT51, BurKG52, BurKG57) gây bệnh thối hạt lúa bằng kỹ thuật sinh học phân tử với cặp mồi đặc hiệu 1416S/1414A là loài Burkholderia glumae. Qua đánh giá khả năng gây hại bệnh thối hạt lúa của 6 dòng vi khuẩn B. glumae (BurVL21, BurDT46, BurDT50; BurDT51, BurKG52, BurKG57) đã tìm ra dòng vi khuẩn BurDT46 được phân lập tại Đồng Tháp gây bệnh thối hạt cao hơn các dòng vi khuẩn còn lại. So sánh khả năng phân giải của 8 dòng thực khuẩn thể (ФBurTV25a, ФBurDT46, ФBurDT47a, ФBurDT47b, ФBurDT48a, ФBurVL34, ФBurVL39, ФBurAG58) trên vi khuẩn BurDT46 đã xác định được bốn dòng thực khuẩn thể (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a và ФBurDT48a) cho đường kính phân giải cao hơn các dòng thực khuẩn thể còn lại.

Nội dung hai là đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối hạt do vi khuẩn B. glumae của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong điều kiện nhà lưới. Đầu tiên, khảo sát khả năng phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn B. glumae DT46 của bốn dòng thực khuẩn thể triển vọng (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a và ФBurDT48a) với việc xử lý từng dòng đơn lẽ hay hỗn hợp 4 dòng ở mật số 10 8 pfu/ml, kết quả cả bốn nghiệm thức xử lý TKT đơn hay HH TKT đều cho hiệu quả giảm bệnh thối hạt khác biệt với nghiệm thức đối chứng.

Trong đó dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 cho hiệu quả giảm bệnh trên 70% cao hơn các nghiệm thức còn lại. Thứ hai, so sánh hiệu quả của dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 ở bốn mật số khác nhau (105 pfu/ml, 106 pfu/ml, 107 pfu/ml và 108pfu/ml) trong phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn B. glumae, kết quả cả xvii bốn mật số thực xviii khuẩn thể đều có tỷ lệ hạt nhiễm bệnh thấp hơn và khác biệt với nghiệm thức đối chứng, đặc biệt mật số 108pfu/ml thể hiện hiệu quả phòng trị bệnh tốt nhất với tỷ lệ hạt bệnh thấp hơn và khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Hơn nữa, xác định được 2 thời điểm áp dụng thực khuẩn thể gồm phun thực khuẩn thể 2 giờ trước khi lây bệnh, hay phun thực khuẩn thể kết hợp 2 giờ trước khi lây bệnh và 5 ngày sau khi lây bệnh cho hiệu quả phòng trị bệnh cao hơn và khác biệt phun thực khuẩn thể 5 ngày sau khi lây bệnh.

Nội dung thứ ba là nghiên cứu định danh các dòng thực khuẩn thể triển vọng nhằm xác định tính an toàn của TKT khi áp dụng trong thực tế sản xuất. Về mặt hình thái cả ba dòng thực khuẩn thể (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đều thuộc họ Podoviridae với đặc điểm đầu là khối đa diện và đuôi ngắn. Về kết quả giải trình tự bộ genome của ba thực khuẩn thể ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a với kích thước bộ genome tuần tự là 44.466 bp, đều có % G+C là 58%, đặc biệt cả ba thực khuẩn thể này đều thuộc nhóm thực khuẩn thể độc (virulent phage hay lytic phages) do bộ gen không có gen qui định enzyme integrase chỉ thể hiện ở thực khuẩn thể ôn hòa. Nội dung thứ tư là đánh giá hiệu quả của các dòng thực khuẩn thể triển vọng phòng trị bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng.

Đầu tiên, khảo sát hiệu quả của việc xử lý thực khuẩn thể ФBurAG58 đơn và hỗn hợp 3 dòng TKT (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a) ở mật số 108 pfu/ml với hai lần phun trước và sau khi trổ ở vụ Đông Xuân 2017-2018, kết quả đã ghi nhận nghiệm thức xử lý TKT ФBurAG58 đơn hay hỗn hợp thực khuẩn thể giảm bệnh thối hạt tương đương với nghiệm thức xử lý oxolinic axit và khác biệt nghiệm thức đối chứng với hiệu quả giảm bệnh khoảng 50%, góp phần bảo vệ tỷ lệ hạt chắc và năng suất lúa. Thứ hai, khảo sát hiệu quả của nghiệm thức xử lý thực khuẩn thể ФBurAG58 đơn và HH TKT (ФBurVL 34, ФBurAG58, ФBurDT47a) ở hai mật số 107 pfu/ml và 108 pfu/ml, kết quả ФBurAG58 (108pfu/ml) và hỗn hợp thực khuẩn thể (108pfu/ml) cho hiệu quả giảm bệnh thối hạt lúa cũng tương đương với nghiệm thức oxolinic axit với hiệu quả giảm bệnh khoảng 50%. Nội dung thứ năm là khảo sát điều kiện nhân nuôi thực khuẩn thể ФBurAG58 trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả ghi nhận môi trường King’s B lỏng, Nutrient lỏng, PDA + Peptone lỏng cho mật số thực khuẩn thể cao hơn và khác biệt với môi trường PDA lỏng.

Tiếp tục khảo sát thời gian cấy vi khuẩn kí chủ trước hay cùng lúc với thời gian cấy TKT lên khả năng nhân nuôi thực khuẩn thể ФBurAG58 trên hai dạng môi trường King’s B (King’s B lỏng và King’B 0,8% agar). Kết quả thực khuẩn thể ФBurAG58 cho mật số cao trong môi trường King’s B lỏng ở điều kiện cấy vi khuẩn B. glumae trước 16 giờ sau đó bổ sung thực khuẩn thể. Ngoài ra, tìm ra chỉ số MOI là 1,0 cho log mật số thực khuẩn thể đạt giá trị 10,00 (tương ứng 1010 pfu/ml) cao hơn chỉ số MOI 0,01 và MOI 0,1.

Cuối cùng, nhiệt độ 300C cho log mật số thực khuẩn thể cao hơn và khác biệt với hai nhiệt độ 270C và 370C vào thời điểm 24 giờ sau khi nhân nuôi. Từ khóa: bệnh thối hạt, Burkholderia glumae, cây lúa, thực khuẩn thể. xix ABSTRACT The thesis was conducted under the plant pathology laboratory and greenhouse conditions of the Plant Protection Department, College of Agriculture, Can Tho University, the location of Vinh Long Province and Kyoto Institute of Technology from 2015 to 2019. The thesis “Study on using of bacteriophages in controlling rice grain rot disease caused by Burkholderia glumae” aimed to select promising bacteriophage strains that are effective in the prevention of rice grain rot caused by B.

glumae in the field, thereby confirming the effectiveness of biological control used by bacteriophages in the management of rice grain rot, contributes to reduce the amount of chemicals in the environment. The thesis is completed with the following main contents: The first content was to isolate, screen the bacteriophages and bacteria that cause rice grain rot.