Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn cho cây đậu tương (Glycine max) tại Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 12/2021 luan an ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS Chu Hoàng Hà 2.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 12/2021 luan an i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Chu Hoàng Hà và GS. Chu Hoàng Mậu. Các kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí và hội nghị khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các kết quả đã trình bày trong luận án. Thái Nguyên, tháng 12 năm 2021 TÁC GIẢ Ngô Mạnh Dũng luan an ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Chu Hoàng Hà và GS. Chu Hoàng Mậu, người đã trực tiếp hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, động viên tôi có được sự tự tin, khắc phục khó khăn để hoàn thành tốt bản luận án này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS. Phạm Bích Ngọc, TS. Đỗ Tiến Phát, ThS Tạ Thị Đông, ThS Nguyễn Hồng Nhung và các cán bộ, nghiên cứu viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ tế bào thực vật và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành các thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ trong bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp tôi tích lũy nhiều kiến thức, phương pháp nghiên cứu về các vấn đề hiện đại của sinh học và công nghệ sinh học, đồng thời đưa ra nhiều đóng góp quý báu để tôi có thể hoàn thành kế hoạch học tập và nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh học, Phòng Đào tạo, Bộ phân đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Tôi xin bày tỏ lòng tri ân và biết ơn sâu sắc tới thầy cô, gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ khó khăn trong suốt chặng đường học tập, nghiên cứu của tôi thời gian qua. Thái Nguyên, tháng 12 năm 2021 TÁC GIẢ Ngô Mạnh Dũng luan an iii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục.

iii Danh mục các chữ viết tắt. vi Danh mục hình. ix Danh mục bảng. xi MỞ ĐẦU.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN VÀ CƠ CHẾ CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT. Ảnh hưởng của stress hạn đến sự sinh trưởng, phát triển và đặc tính sinh lý, sinh hoá của thực vật. Phản ứng của thực vật trong điều kiện stress hạn.

GLYCINE BETAINE, CHOLINE OXIDASE. NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở ĐẬU TƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN. Cây đậu tương. Chuyển gen ở đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Nâng cao khả năng chịu hạn ở đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen. Tình hình nghiên cứu chuyển gen codA ở thực vật. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.

Vật liệu thực vật. Các chủng vi khuẩn và các loại vector. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ.

48 luan an iv 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen codA và chuyển gen ở thuốc lá. Nhóm phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp cho chuyển gen ở giống đậu tương ĐT22.

Nhóm phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen codA. Phân tích và xử lý dữ liệu. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.

THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA. Tạo cấu trúc chuyển gen codA. Đánh giá hoạt động của vector mang gen chuyển codA trên cây thuốc lá. Thảo luận kết quả thiết kế vector và hoạt động của vector biểu hiện trên cây thuốc lá.

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN CODA Ở GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22. Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến khả năng tạo chồi đậu tương. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn và thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi đậu tương. Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh và thời gian diệt khuẩn đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi đậu tương.

Thảo luận kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả chuyển gen codA ở giống đậu tương ĐT22. BIẾN NẠP GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VÀ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN CHỊU HẠN. Kết quả chuyển gen codA vào giống đậu tương ĐT22. Phân tích cây đậu tương chuyển gen.

Thử nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen. Thảo luận kết quả biến nạp gen codA vào giống đậu tương ĐT22 và thử nghiệm khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen. 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.101 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .102 TÀI LIỆU THAM KHẢO .103 luan an vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid APX Ascorbate peroxidase BADH Betaine aldehyde dehydrogenase BAP 6-benzyladenine purin bar Bialaphos resistance bp Base pair Cặp base CAM Crassulacean acid metabolism CAT Catalase CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy CHDH Choline dehydrogenase CMO Choline monooxygenase COD Choline oxidase codA Choline oxidase from Agrobacterium globiformis CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide DHAR Dehydroascorbate reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DW Dry weight Khối lượng khô ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAD Flavin adenine dinucleotide FW Fresh weight Khối lượng tươi GA3 Gibberellic acid GB Glycine Betaine GM Germination medium Môi trường nảy mầm HSP Heat shock protein luan an vii IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid kb Kilo base kDa Kilo Dalton Môi trường dinh dưỡng cơ LB Luria Bertani bản nuôi cấy vi khuẩn LEA Late embryogenesis abundant MAPK Microtubule associated protein kinase MDA Malondialdehyde MDHAR Monodehydroascorbate reductase MES 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Môi trường dinh dưỡng MS Murashige and Skoog cơ bản MS mRNA Messenger ribonucleic acid NAA α-Naphthaleneacetic acid OD Optical density Mật độ quang pat Phosphinothricin acetyltransferase PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PEAMT phosphoethanolamine N-methyltransferase PEG Polyethylene glycol PEPC Phosphoenolpyruvate carboxylase PHBH p-hydroxybenzoate hydroxylase POD Peroxidase PPT Phosphinothricin rd29A Response-to-Dehydration 29A RM Rooting medium Môi trường ra rễ ROS Reactive oxygen species SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi luan an viii SIM Shoot induction medium Môi trường tạo chồi SOD Superoxide dismutase Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase Vùng DNA plasmid T-DNA Transfer DNA chuyển vào thực vật Ti- plasmid Tumor inducing - plasmid T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen KLK Khối lượng khô UV Ultraviolet Tia cực tím WT Wild type Cây không biến nạp 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- X-gal galacto-pyranoside YEP Yeast extract peptone Cao chiết nấm men luan an ix DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc không gian (a) và cấu trúc phân tử (b) của GB.

Các con đường sinh tổng hợp GB. Quá trình oxy hóa choline thành GB xúc tác bởi choline oxidase. Cấu trúc không gian của choline oxidase độ phân giải 1,86 Å. Vị trí hoạt động của choline oxidase kiểu dại với sản phẩm hoạt động .25 liên kết với GB [150].

Lối vào vị trí hoạt động của choline oxidase [137]. Trình tự gen codA được tổng hợp bởi Epoch Life Science Inc. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát. Sơ đồ các vector pIBTII-rd29A-codA, pIBTII-HSP-codA, pIBTII-35S- codA.

Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pIBTII và pCAMBIA bằng enzyme HindIII và EcoRI. Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn E. coli chứa các vector thiết kế. Ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pIBTII mang các cấu trúc gen thiết kế.

Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn A. tumefaciens C58 mang các cấu trúc gen thiết kế. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá chuyển gen. Chồi thuốc lá chuyển gen chọn lọc trên môi trường bổ sung PPT 1,5 mg/l.

Kết quả gây hạn sinh lý bằng PEG 8000 2,5% các dòng thuốc lá chuyển gen. Kết quả định lượng hàm lượng GB trong các dòng thuốc lá chuyển gen 69 Hình 3. Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc SIM2 với nồng độ PPT khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy .74 luan an x Hình 3. Các mảnh lá mầm sau các thời gian đồng nuôi cấy khác nhau.

Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tạo cây đậu tương chuyển gen. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 bằng PPT. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng PPT. Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR.

Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR. Kết quả phân tích Southern blot các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1. Kết quả phân tích Western blot các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1. Khả năng nảy mầm của đậu tương sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường hạn nhân tạo.

Chiều dài thân mầm của các dòng hạt đậu tương trên môi trường hạn nhân tạo. Kiểu hình của các dòng đậu tương vào ngày thí nghiệm thứ 9 trong điều kiện hạn nhân tạo. Sinh khối thu được vào ngày thứ 9 của các dòng đậu tương trong thí nghiệm chịu hạn nhân tạo. Hàm lượng GB của các dòng đậu tương chịu hạn.

Hàm lượng proline của các dòng đậu tương chịu hạn. Hàm lượng MDA của các dòng đậu tương chịu hạn. Hoạt độ POD của các dòng đậu tương chịu hạn .97 luan an xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Một số loài cây trồng chuyển gen codA mã hóa choline oxidase sinh tổng hợp GB tăng khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học.

Trình tự các cặp mồi đặc hiệu. Thành phần phản ứng nối với T4 ligase. Môi trường nuôi khuẩn. Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen codA ở đậu tương.

Kết quả biến nạp gen codA vào giống thuốc lá K326 sử dụng PPT sàng lọc.