Luận án tiến sĩ sinh học: Nuôi cấy in vitro và biểu hiện F3'5'H tăng flavonoid ở cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HOÀNG THỊ THU HOÀN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO VÀ BIỂU HIỆN FLAVONOID 3’5’ HYDROXYLASE NHẰM TĂNG CƢỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở CÂY Ô ĐẦU (Aconitum carmichalii Debx.) LU N N TI N S SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HOÀNG THỊ THU HOÀN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO VÀ BIỂU HIỆN FLAVONOID 3’5’ HYDROXYLASE NHẰM TĂNG CƢỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở CÂY Ô ĐẦU (Aconitum carmichalii Debx.) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LU N N TI N S SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan THÁI NGUYÊN - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của GS. Chu Hoàng Mậu và TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan.

Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trong các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chƣa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung và các số liệu đã trình bày trong luận án. Thái Nguyên, tháng 02 năm 2022 T C GIẢ Hoàng Thị Thu Hoàn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.

Chu Hoàng Mậu và TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan đã tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ, động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. Lê V n Sơn và các cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh học và Phòng Đào tạo, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến các đồng nghiệp, lãnh đạo Khoa Nông – Lâm – Ngƣ nghiệp và Lãnh đạo trƣờng Đại học Tân Trào Tuyên Quang đã động viên, chia sẻ và tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành khóa học này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng tri ân và biết ơn sâu sắc đối với thầy cô, gia đình và bạn bè là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ những khó kh n và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập của mình.

Luận án tiến sĩ này đƣợc sự hỗ trợ kinh phí của Bộ Giáo dục&Đào tạo trong khuôn khổ đề tài ―N n u u n nm vono 3 5 - y roxy s đ tăn ườn tí ũy vono ở ây Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx.)‖, mã số: B2020-TNA-11 do TS Nguyễn Thị Ngọc Lan làm chủ nhiệm. Tác giả chân thành cảm ơn sự hỗ trợ của nhóm nghiên cứu và Bộ Giáo dục&Đào tạo Việt Nam. Thái Nguyên, tháng 02 năm 2022 T C GIẢ Hoàng Thị Thu Hoàn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC.iii DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC CÁC BẢNG.

ix DANH MỤC CÁC HÌNH. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Đặc điểm sinh học của cây Ô đầu. Thành phần dƣợc chất và giá trị dƣợc học ở cây Ô đầu.

Nghiên cứu định danh cây Ô đầu. NUÔI CẤY IN VITRO VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY DƢỢC LIỆU. Hệ thống tái sinh đa chồi ở cây dƣợc liệu. Nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ ở cây dƣợc liệu.

FLAVONOID VÀ NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN FLAVONOID 3’5’ HYDROXYLASE. Đặc điểm về cấu trúc hóa học và vai trò của flavonoid. Con đƣờng tổng hợp flavonoid ở thực vật. Enzyme flavonoid 3’5’-hydroxylase (F3’5’H).

Biểu hiện gen mã hóa flavonoid 3’5’ hydroxylase. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nhóm phƣơng pháp định danh loài Ô đầu. Nhóm phƣơng pháp nuôi cấy in vitro và cảm ứng tạo rễ tơ in vitro. Nhóm phƣơng pháp tách dòng gen và thiết kế vector chuyển gen.

Nhóm phƣơng pháp chuyển gen và phân tích cây chuyển gen. Xử lý số liệu thống kê. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

KẾT QUẢ ĐỊNH DANH LOÀI Ô ĐẦU (Aconitum carmichaelii). Đặc điểm hình thái các mẫu Ô đầu thu ở Hà Giang. Đặc điểm trình tự nucleotide của vùng ITS và các đoạn gen matK, rpoC1, rpoB2. Thảo luận kết quả định danh mẫu Ô đầu.

KẾT QUẢ THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY IN VITRO VÀ TẠO RỄ TƠ Ở CÂY Ô ĐẦU. Thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro phục vụ chuyển gen ở cây Ô đầu. Nuôi cấy tạo rễ tơ ở cây Ô đầu. Thảo luận kết quả thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây Ô đầu.

KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN, THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA FLAVONOID 3’5’ HYDROXYLASE VÀ TẠO CHỦNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENCE MANG VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT. Phân lập gen A F3 5 H từ cây Ô đầu. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen A F3 5 H. Tạo Agrobacterium tumefaciens CV58 chứa vector chuyển gen pCB301_A F3 5 H.

Thảo luận kết quả thiết kế vector biểu hiện gen A F3 5 H và tạo chủng A. tumefacience mang vector chuyển gen thực vật. PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN A F3 5 H Ở CÂY THUỐC LÁ. Biến nạp di truyền và biểu hiện protein tái tổ hợp F3’5’H ở cây thuốc lá chuyển gen A F3 5 H.

Hàm lƣợng flavonoid tổng số trong lá của các dòng thuốc lá chuyển gen. Thảo luận kết quả biến nạp và biểu hiện gen A F3 5 H trong cây thuốc lá 100 3. BIẾN NẠP DI TRUYỀN VÀ PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN A F3 5 H Ở CÂY Ô ĐẦU. Biến nạp gen uidA vào cây Ô đầu.

Biến nạp và biểu hiện gen A F3 5 H ở cây Ô đầu. Thảo luận kết quả biến nạp và biểu hiện mạnh gen A F3 5 H ở cây Ô đầu 109 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 111 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

115 PHỤ LỤC LUẬN ÁN. 138 vi DANH MỤC KÍ HIỆU, C C TỪ VÀ CHỮ VI T TẮT Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Aconitum carmichaelii Gen A F3 5 H phân lập từ A F3 5 H falvonoid 3’5’ hydroxylase Cây Ô đầu AS Acetosyringone Chất kích hoạt gen vir BAP Benzylaminopurine bp base pair Cặp bazơ nitơ CCM Co-cultivation medium Môi trƣờng đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA DNA bổ sung Enzyme chuyển hóa CHI Chalcone isomerase chalcon Enzyme xúc tác tổng hợp CHS Chalcone synthase chalcon cs Cộng sự Cetyltrimethyl ammonium Chất tẩy rửa có tính khử CTAB bromide mạnh 2,4-Dichlorophenoxyacetic 2,4 D acid Dihydroxyflavonol 4- DFR reductase DNA Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside dNTPs triphosphate Da, KDa Dalton, kilodalton Đơn vị khối lƣợng phân tử Enzyme-linked ELISA immunosorbent assay GUS β-Glucuronidase F3H Flavanone 3-hydroxylase F3’H Flavonoid 3’-hydroxylase F3’5’H Flavonoid 3’5’-hydroxylae vii Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt FLS Flavonol synthase FST Flavonol 4-sulfo transferase GA3 Gibberellic acid GM Germination medium Môi trƣờng nảy mầm IAA Idole acetic acid IBA Idolbutylic acid Chất kích thích sinh trƣởng Kin Kinetin tạo chồi Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ LB Luria Bertani bản nuôi cấy vi khuẩn Leucoanthocyanidin LDOX oxygenase mRNA Messenger ribonucleic acid Môi trƣờng nuôi cấy mô MS Murashige và Skoog, 1962 thực vật của Murashige và Skoog NAA Naphthalene acetic acid Nicotinamide adenine NADP dinucleotide phosphate Nicotinamide adenine NADPH dinucleotide phosphate- oxidase OD Optical density Mật độ quang Ori Origin PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase Ri-plasmid Root inducing- plasmid Plasmid tạo rễ tơ RM Rooting medium Môi trƣờng tạo rễ RNA Ribonucleic acid Rol Root locus Gen rol rpm Revolutions per minute Số vòng/ phút RT-PCR Reverse Transcription Phản ứng khuếch đại viii Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Polymerase Chain Reaction cDNA từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc SEM Shoot elongation medium Môi trƣờng kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Taq DNA Thermus aquaticus DNA DNA-polymerase chịu polymerase polymerase nhiệt Đoạn DNA đƣợc chuyển T-DNA Transfer DNA vào mô thực vật Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u T0 Các thế hệ cây chuyển gen Vùng biên trái đoạn DNA TL-DNA Transfer left -DNA đƣợc chuyển vào thực vật Vùng biên phải đoạn DNA TR-DNA Transfer right -DNA đƣợc chuyển vào thực vật UDP-glucose flavonoid 3-O- Enzyme xúc tác phản ứng UFGT glucosyl tranferase O-glycosyl hóa Vir Virus interferon resistance Gen vir WT Wild type Cây không biến nạp gen ix DANH MỤC C C BẢNG Bảng 2. Các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu. Thành phần phản ứng PCR.

Thành phần phản ứng gắn gen A F3 5 H vào vector tách dòng. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro từ đoạn thân cây Ô đầu. Ảnh hƣởng của BAP và Kinetin đến cảm ứng tạo chồi từ đoạn thân cây Ô đầu. Ảnh hƣởng của α-NAA và IBA đến sự tạo rễ của chồi Ô đầu trên môi trƣờng MS cơ bản.

Ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống và chất lƣợng cây Ô đầu giai đoạn vƣờn ƣơm sau 4 tuần. Sự sinh trƣởng của rễ tơ Ô đầu sau 6 tuần trên các loại môi trƣờng khác nhau. Những vị trí sai khác về trình tự amino acid suy diễn của gen A F3 5 H và trình tự gen mang mã số JN635708. Các đối tƣợng thực vật có trình tự gen F3 5 H trong 100 trình tự xuất hiện nhiều nhất trong GenBank.

Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển A F3 5 H vào thuốc lá. Hàm lƣợng flavonoid tổng số của các dòng thuốc lá chuyển gen T01, T03, T05, T014 và cây đối chứng. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển A F3 5 H vào Ô đầu. Hàm lƣợng flavonoid tổng số của ba dòng Ô đầu chuyển gen và cây WT.

108 x DANH MỤC C C HÌNH Hình 1. Hình ảnh cây Ô đầu.