Luận án tiến sĩ nghiên cứu tách điều chế chất chuẩn và xây dựng quy trình phân t

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Huế - Năm 2020 i ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Hóa Phân tích Mã số: 9 44 01 18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Đình Luyện 2. Nguyễn Hữu Tùng Huế - Năm 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Luận án này đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. Nguyễn Đình Luyện và PGS.

Nguyễn Hữu Tùng. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả trong luận án là trung thực, đƣợc các đồng tác giả cho phép sử dụng và chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đó. Tác giả Đoàn Mạnh Dũng i LỜI CẢM ƠN Luận án đƣợc hoàn thành dƣới sự hƣớng dẫn hết sức tận tình và đầy tâm huyết của Thầy Nguyễn Đình Luyện và Thầy Nguyễn Hữu Tùng.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS. TS Nguyễn Đình Luyện - Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Huế, PGS. Nguyễn Hữu Tùng - Trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội là ngƣời đã giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Đặc biệt tôi xin tỏ lòng kính trọng nhất với GS.

TS Trần Đình Thắng – Trƣờng Đại học Vinh, ngƣời Thầy đã dìu dắt, hỗ trợ mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trên con đƣờng nghiên cứu khoa học. Nhân dịp này, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, Phòng Sau đại học, Khoa Hóa học cùng quý thầy cô giáo giảng dạy lớp nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tác giả xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp gần xa đã giúp đỡ, động viên, khích lệ tác giả trong suốt quá trình làm luận án. Cuối cùng, tác giả xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, ngƣời thân và các ngƣời bạn của tác giả, những ngƣời đã luôn mong mỏi, động viên và tiếp sức cho tác giả để hoàn thành bản luận án này.

Tác giả Đoàn Mạnh Dũng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. II MỤC LỤC. III KÝ HIỆU VIẾT TẮT. V DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU.

VII DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ. IX MỞ ĐẦU. Giới thiệu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học và một số cây thuốc. Giới thiệu chung.

Các nghiên cứu về tách chiết một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Một số loài cây thuốc chứa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Các phƣơng pháp phân tích các hợp chất thiên nhiên. Phƣơng pháp sắc ký khí.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng. Một số nghiên cứu liên quan đến luận án. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Phƣơng pháp nghiên cứu. Thông tin về mẫu. Phƣơng pháp chiết tách/phân lập.

Phƣơng pháp xác định cấu trúc và đặc trƣng hóa - lý của HCTN. Phƣơng pháp tinh chế hctn để tạo ra chất chuẩn. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn và dữ liệu chất chuẩn. Phƣơng pháp phân tích các HCTN.

Phƣơng pháp đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích. Phƣơng pháp xử lý số liệu. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Chiết tách và xác định cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên. Chiết tách các HCTN từ cây Diệp hạ châu và đặc trƣng cấu trúc. Chiết tách các HCTN từ cây Đan sâm và đặc trƣng cấu trúc. Chiết tách các HCTN từ cây Mật nhân và đặc trƣng cấu trúc.

Tinh chế hợp chất thiên nhiên để tạo ra chất chuẩn. Chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin. Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA. Chất chuẩn eurycomanone.

Quy trình phân tích hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Tính ổn định của hệ thống thiết bị. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp phân tích. Khoảng tuyến tính.

Áp dụng thực tế. Kiểm soát chất lƣợng của phƣơng pháp phân tích. Hàm lƣợng các hctn trong các mẫu thực tế. Các hợp chất acetogenin chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm.

Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin. Định tính các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3. Định lƣợng các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3. Hàm lƣợng tinh dầu chiết tách từ cây Riềng đuôi nhọn .105 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

109 Danh mục các công trình công bố kết quả nghiên cứu của luận án .122 iv KÝ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Việt Tiếng Anh ACN Acetonitril ACRS Chất chuẩn đối chiếu hóa Asean Chemical học của ASEAN Reference Substance AOAC Hiệp hội các nhà khoa Association of Official học Phân tích Hoa Kỳ Analytical Chemists ASEAN Hiệp hội các nƣớc Đông Association of Southeast Nam Á Asian Nations CCĐC Chất chuẩn đối chiếu CE Điện di mao quản Capillary Electrophoresis DAD Detector chuỗi diot Diot Array Detector ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun Electron Spray Ionisation mù electron – Mass Spectrometry EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FLD Detector huỳnh quang Fluorescence Detector GC Sắc kí khí Gas Chromatography GC-MS Sắc ký lỏng ghép nối Gas Chromatography – khối phổ Mass Spectrometry HCTN Hợp chất thiên nhiên HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid Chromatography HPLC-MS Sắc kí lỏng - khối phổ High Performance Liquid Chromatography– Mass Spectrometry HTSH Hoạt tính sinh học Bioactive HCTN Hợp chất thiên nhiên Natural compounds v Viết tắt Tiếng Việt Tiếng Anh LC-MS/MS Sắc ký lỏng ghép 2 lần Liquid Chromatograph khối phổ Tandem Mass Spectrometer LOD Giới hạn phát hiện Limit of detection LOQ Giới hạn định lƣợng Limit of quantity MeOH Methanol NMR Cộng hƣởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance NPLC Sắc ký lỏng pha thuận Normal Phase Liquid Chromatography PPPT Phƣơng pháp phân tích Analysis method PTN Phòng thí nghiệm Laboratory RPLC Sắc ký lỏng pha đảo Reversed Phase Liquid Chromatography RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối Relative Standard Deviation SKĐ Sắc kí đồ SPE Chiết pha rắn Solid Phase Extraction TCCL Tiêu chuẩn chất lƣợng TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography UV-Vis Tử ngoại – khả kiến Ultraviolet – Visible VQG Vƣờn quốc gia vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu. Dữ liệu phổ NMR của PU-1 và so sánh với công bố ở tài liệu. Dữ liệu phổ NMR của PU-2 và so sánh với công bố ở tài liệu.

Dữ liệu phổ NMR của SM-1 và so sánh với công bố ở tài liệu. 4 Dữ liệu phổ NMR của SM-2 và so sánh với công bố ở tài liệu. Dữ liệu phổ NMR của SM-3 và so sánh với công bố ở tài liệu. Dữ liệu phổ NMR của EL-1 và so sánh với công bố ở tài liệu.

Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn tanshinone I, cryptotashinone và tanshinone IIA. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn eurycomanone. Kết quả khảo sát tính ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin.

Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích Eurycomanone. Kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, và phân tích Eurycomanone. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các PP LC-MS/MS và UPLC-DAD.

Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với hypophyllanthin và phyllanthin. Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất hypophyllanthin, phyllanthin và eurycomanone. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA.

Hàm lƣợng (mg/g) hypophyllanthin và phyllanthin trong các mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu. Hàm lƣợng (mg/g) tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone trong các mẫu cây Đan sâm. Hàm lƣợng (mg/g) eurycomanone trong cây Mật nhân ở các địa phƣơng khác nhau. Phƣơng trình đƣờng thêm chuẩn và LOD, LOQ của phƣơng pháp phân tích.

Hàm lƣợng (%) các cấu tử và các nhóm hợp chất có mặt trong tinh dầu chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn .102 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3. Công thức cấu tạo của hypophyllanthin. Công thức cấu tạo của phyllanthin. Công thức cấu tạo của cryptotanshinone.

Công thức cấu tạo của tanshinon IIA. Công thức cấu tạo của Tanshinon I. Công thức cấu tạo của Eurycomanone. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của hypophyllanthin:.

Sắc đồ xác định độ tinh khiết của phyllanthin:. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone I:. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của cryptotanshinone:. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone IIA.

Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất eurycomanone:. Phổ ESI-MS của hợp chất hypophyllanthin. Phổ ESI-MS của hợp chất phyllanthin. Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin bằng phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD.

Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone I. Phổ ESI-MS của hợp chất cryptotanshinone. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone IIA. Quy trình phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA bằng phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD.

Quy trình phân tích eurycomanone bằng phƣơng pháp LC-MS/MS. Phổ ESI-MS của hợp chất eurycomanone. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) hypophyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau (b) phyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau và (c) hypophyllanthin và phyllanthin. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) tanshinone I, ứng với các nồng độ khác nhau; (b) cryptotanshinone, ứng với các nồng độ khác nhau; (c) tanshinone IIA, ứng với các nồng độ khác nhau; và (d) tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA.

Sắc đồ LC-MS/MS đối vơi dung dịch chuẩn chứa: eurycomanone, ứng ix với các nồng độ khác nhau. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với hypophyllanthin trong phƣơng pháp LC-MS/MS. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với phyllanthin trong phƣơng pháp LC- MS/MS. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với (a) hypophyllanthin và (b) phyllanthin trong phƣơng pháp UPLC-DAD.

Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone I trong phƣơng pháp LC- MS/MS .