Luận án TS Ngô Ngọc Trung: Phát triển bộ kít aptamer phát hiện độc tố ricin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ NGỌC TRUNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ APTAMER LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ NGỌC TRUNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ APTAMER Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : 1. TS Lê Quang Huấn 2. TS Nguyễn Đình Thắng HÀ NỘI - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào, các dữ liệu tham khảo được trích dẫn đầy đủ.

Hà Nội, ngày 08 tháng 11 năm 2020 Tác giả luận án Ngô Ngọc Trung LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn PGS. TS Lê Quang Huấn, PGS.TS Nguyễn Đình Thắng đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn em thực hiện nội dung của luận án. Em xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Công nghệ tế bào động vật/ Viện Công nghệ Sinh học/Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học/ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đã quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi và dành thời gian cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ, đồng nghiệp tại Viện Hóa học Môi trường quân sự/ Bộ Tư lệnh Hóa học đã có những chia sẻ, động viên trong những năm em thực hiện luận án.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận án. Hà Nội, tháng 11 năm 2020 Nghiên cứu sinh Ngô Ngọc Trung MỤC LỤC Trang Danh mục các chữ viết tắt i Danh mục các bảng iii Danh mục các hình v MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1.1 Ricin từ hạt Thầu Dầu 3 1. Cấu trúc phân tử và cơ chế tác động của ricin 4 1.1 Cấu trúc phân tử của ricin 4 1.2 Cơ chế tác động của ricin 7 1.3 Độc tính và ứng dụng của ricin 9 1.1 Độc tính của ricin 9 1.2 Ứng dụng trong y học 9 1.3 Ứng dụng trong quân sự 10 1.4 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch ricin 11 1.1 Các phương pháp tách chiết ricin 11 1.2 Các phương pháp tinh sạch ricin 11 1.5 Tình hình nghiên cứu về ricin trong và ngoài nước 12 1.1 Tình hình nghiên cứu ricin trên thế giới 12 1.2 Tình hình nghiên cứu ricin tại Việt Nam 13 1.6 Các phương pháp phát hiện ricin 13 1.1 Phương pháp miễn dịch đánh dấu phóng xạ (RIA) 13 1.2 Phương pháp sử dụng cảm biến sinh học 14 1.3 Phương pháp sắc ký miễn dịch 15 1.4 Phương pháp ELISA 16 1.5 Phương pháp PCR, RT-PCR và I-PCR 17 1.6 Một số phương pháp khác 20 1.2 APTAMER VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN RICIN 21 1.1 Giới thiệu về aptamer 21 1.2 Các quy trình thu nhận aptamer 23 1.1 Quy trình SELEX 23 1.2 Quy trình SELEX sử dụng màng lọc nitrocellulose 24 1.3 Quy trình SELEX sử dụng sắc ký ái lực và hạt từ 24 1. Các phương pháp xác định ái lực của aptamer với phân tử đích 25 1.4 Nghiên cứu về sự tương tác giữa aptamer và ricin 26 1.5 Thư viện aptamer sử dụng trong sàng lọc ricin 27 1.6 Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước 28 1.1 Các nghiên cứu của aptamer phát hiện kháng nguyên 28 1.2 Các nghiên cứu về aptamer phát hiện ricin 29 1.7 Thành phần và nguyên lý hoạt động của một số bộ kít phát hiện ricin 30 1.1 Bộ kít phát hiện ricin theo phương pháp ELISA 30 1.2 Bộ kít phát hiện ricin theo phương pháp real-time PCR 32 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU VÀ HÓA CHẤT 34 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 34 2.2 Các hóa chất chính 35 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ricin 35 2.1 Tách chiết ricin từ hạt Thầu Dầu 35 2.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel 36 2.

Các phương pháp xác định ricin 36 2.1 Xác định hàm lượng protein 36 2.2 Xác định độ tinh sạch của ricin bằng phương pháp điện di 36 2.3 Phân tích khối phổ xác định ricin (LC-MS/MS) 36 2.4 Phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện ricin 37 2.5 Xác định hàm lượng ricin tương đối dựa trên test phát hiện nhanh 38 2.6 Kiểm tra sự có mặt của ricin bằng phương pháp Western blot 38 2.3 Phương pháp SELEX cải tiến sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin 40 2.1 Chuẩn bị thư viện ssDNA thứ cấp 41 2.2 Gắn kết aptamer và Q sepharose fast flow 41 2.3 Rửa, giải hấp và thu sản phẩm 42 2.4 Các phương pháp sử dụng để chọn lọc aptamer 43 2.1 Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR 44 2.2 Phản ứng gắn ADN vào vector tách dòng 45 2.3 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.4 Chọn dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp 46 2.5 Phương pháp giải trình tự axit nucleic tự động 47 2.6 Phương pháp điện di trên gel agarose 47 2.7 Phương pháp tính giá trị hằng số phân ly K d 47 2.8 Dự đoán cấu hình không gian của aptamer 48 2.5 Phương pháp chọn dòng aptamer bằng Enzyme – Limked Aptamer Assay 48 (ELAA) 2.6 Xác định ricin bằng phương pháp Enzyme - Linked Aptamer Assay 49 (ELAA) 2.7 Xác định ricin bằng phương pháp Real-time PCR 50 2.1 Xây dựng mối tương quan giữa ricin với aptamer Ar5.2 Phương pháp real-time PCR để phát hiện aptamer Ar5.8 Thẩm định sự phù hợp của phương pháp 51 2.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 52 2.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 52 2.3 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu 52 2.4 Xác định độ chính xác, độ không đảm bảo đo 53 2.5 Độ ổn định của phương pháp 56 2.9 Phương pháp lấy mẫu nước 57 2.10 Phương pháp thống kê trong xử lý kết quả thí nghiệm 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 58 3. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH RICIN TỪ HẠT THẦU DẦU 58 3.1 Tách chiết protein tổng số từ hạt Thầu Dầu 58 3.2 Kết quả tinh sạch ricin 60 3.1 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion 60 3.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký lọc gel 62 3.3 Kết quả xác định ricin bằng sắc ký khối phổ LC- MS/MS 66 3.2 NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU RICIN 70 3.1 Chuẩn bị thư viện TV40 70 3.2 Nhân aptamer sợi đơn (ssADN) từ thư viện TV40 bằng phản ứng PCR 73 mồi lệch, cặp ApF2/ApR2 3.3 Sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin 71 3.4 Kết quả tách dòng và giải trình tự nucleotide của aptamer 72 3.5 Xác định giá trị Kd cho các aptamer đặc hiệu ricin 76 3.6 Xác định tính đặc hiệu của aptamer Ar5.3 KẾT QUẢ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP VÀ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN 86 RICIN 3.1 Phát triển phương pháp phát hiện ricin bằng Aptamer Ar5.9 dựa trên 86 nguyên lý ELAA 3.1 Khảo sát các thành phần phản ứng ELAA 86 3.2 Xây dựng đường chuẩn giữa ricin và aptamer Ar5.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 89 3.4 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp ELAA 90 3.5 Xác định khả năng phản ứng chéo trong phương pháp ELAA 93 3.6 Xác định độ chính xác của phương pháp 94 3.7 Xác định độ thu hồi và độ không đảm bảo đo của phương pháp 96 3.8 Xác định độ ổn định của phương pháp theo thời gian 97 3.2 Phát triển phương pháp phát hiện ricin bằng Aptamer Ar5.9 dựa trên kỹ 99 thuật real-time PCR 3.1 Kết quả kiểm tra phản ứng real-time PCR với aptamer Ar5.2 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu tách aptamer Ar5.9 từ phức hợp kháng 100 thể đơn dòng - ricin - Aptamer Ar5.3 Khảo sát một số thành phần của phản ứng real-time PCR 101 3.4 Xây dựng đường chuẩn giữa ricin - aptamer Ar5.5 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 107 3.6 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp 108 3.7 Xác định khả năng phản ứng chéo của phương pháp real-time PCR 109 3.8 Xác định độ chính xác của phương pháp 110 3.9 Xác định độ thu hồi và độ không đảm bảo đo của phương pháp 112 3.10 Xác định độ ổn định của phương pháp theo thời gian 113 3.3 Đánh giá, so sánh 02 phương pháp phát hiện ricin 115 3.4 Nghiên cứu sản xuất bộ kít phát hiện ricin trong mẫu nước 116 3.1 Xây dựng quy trình sản xuất kít phát hiện ricin bằng phương pháp real- 116 time PCR kết hợp aptamer Ar5.2 Đặc tính kỹ thuật của bộ kít 118 3.3 Quy trình phân tích 119 3.4 Kết quả thực hành sử dụng trong phát hiện ricin tại hiện trường 120 3.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của bộ kít 124 3.1 Ảnh hưởng của một số kim loại nặng 124 3.2 Ảnh hưởng của một số loại ion vô cơ 125 3.