Luận án tiến sĩ: Hoạt hóa tế bào hình sao gan liên quan tự thực bào

LE VAN TRINH NGHIEN CUU SU HOAT HOA GIAI DOAN SOM IN VITRO VA IN VIVO CUA TE BAO HINH SAO GAN TRONG MOI QUAN HE VỚI SU TỰ THUC LUAN AN TIEN Si TP. Hồ Chi Minh — Nam 2023 VIET NAM NATIONAL UNIVERSITY - HO CHI MINH UNIVERSITY OF SCIENCE LE VAN TRINH STUDY ON INITIAL ACTIVATION PHASE OF HEPATIC STELLATE CELLS IN VITRO AND IN VIVO IN RELATION TO AUTOPHAGY Doctoral Thesis Ho Chi Minh City — 2023 _ ĐẠI HỌC QUOC GIA TP. HCM ` TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ VĂN TRÌNH NGHIÊN CUU SỰ HOAT HÓA GIAI DOAN SOM IN VITRO VA IN VIVO CUA TE BAO HINH SAO GAN TRONG MOI QUAN HE VỚI SỰ TỰ THỰC Ngành: Công nghệ sinh học Mã sô ngành: 9420201 Phản biện 1: PGS. Vòng Bính Long Phản biện 2: PGS.

Trần Công Toại Phản biện 3: TS. Phạm Lê Bửu Trúc Phản biện độc lập 1: miễn Phản biện độc lập 2: miễn NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TRƯƠNG HAI NHUNG TP. Hồ Chi Minh — Năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sinh học, với đề tài “Nghiên cứu sự hoạt hóa giai đoạn sớm in vitro và in vivo của tế bảo hình sao gan trong mối quan hệ với sự tự thực” là công trình khoa học do Tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS TS Trương Hải Nhung.

Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và không trùng lap với các công trình đã công bô trong và ngoai nước. Nghiên cứu sinh (Ký tên, ghi họ tên) LÊ VĂN TRÌNH LỜI CẢM ƠN Đê hoàn thành luận án này, Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành tới: Các cơ quan cấp kinh phí dé thực hiện luận án gồm: Quy phát triển khoa học và công nghệ quốc gia với đề tài Nafosted mã số 108.30, ĐHQG HCM với đề tài C ĐHQG mã số C2021-18-10. Sự hướng dẫn tận tình và tạo điều kiện tối đa của CBHD hướng dẫn, Cô PGS TS Trương Hải Nhung. Quí Thầy Cô, các thế hệ lãnh đạo, nhân viên, và đồng nghiệp tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu va Ứng dụng Tế bào gốc, cũng như Viện Tế bào gốc, Trường đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG HCM.

Các đóng góp to lớn của các thế hệ đồng nghiệp, nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và các Thầy Cô có vấn, hợp tác với Nhóm Khoa học tái tạo gan và tiêu hóa. Các cơ quan don vi gồm: Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học và Công nghệ Sinh học, va các cơ quan đơn vi đã hợp tac, tạo điều kiện cho Tôi hoàn thành luận án này. Xin cảm ơn! LOT CAM DOAN.- chư i LOT CAM ƠN. tt nh HHre ii i1908 109 0.

1H TRANG THONG TIN LUẬN ÁN .---- 2 52522E22EE2ESEEEE121121121 2111211212 re vii DANH MỤC HÌNH ẢNH. e6 xi DANH MỤC BANG BIBU w.ccccsccsessssssssscsscscssescscsvcscsscsvssesesscsesicsesicsesscsssesneseeseaes xiv DANH MUC TU VIET TAT .occcceccccccccsscssssssssssessessesssssssuesscsessesussucsessessesssesssnsaeeees XV CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU.-- 25+ 2t tt tt re | CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIBU .- 2 2 2 SSE£E£2E£2EE£EEtEEezEzEzresrxee 5 2.1 Bệnh lý xơ gan và tế bào hình sao.---- 2 + Sc x+Sx‡EE2E2E2EeExerxerxerrrrrkee 5 2.1 Gan và bệnh ly xơ Øañ. --- cv HT TH nh 5 2.2 Tế bào hình sao gan: tên gọi và lich sử nghiên cứu.3 Tế bào hình sao gan: hình thái và cấu trúc .4 Tế bào hình sao gan: marker phan tử.5 TẾ bào hình sao gan: chức năng sinh lý.6 Vai trò của tế bào hình sao gan trong bệnh lý xơ gan.7 Điều trị bệnh lý xo gan nhắm trúng dich tế bào hình sao .2 Sự tự thực bao và vai trò của sự tự thực bào ở gan.1 Sự tự thực ĐàO. HH TH TH HH HH HH HH 24 2.2 Quá trình tự thực bào.3 Các phương pháp đánh giá sự tự thực bào.4 Vai trò của sự tự thực bào ở các tế bào gan góp phần vào bệnh ly xơ gan.3 Mô hình nghiên cứu tế bào hình sao gan it vifr0.1 Phân lập tế bào hình sao gan sơ cấp.2 Các mô hình nuôi cấy tế bào hình sao gan in wif0.3 Mô hình dòng tế bào hình sao gan thương mạii.4 Tình hình nghiên cứu về van đề đặt ra bởi đề tài.

38 CHƯƠNG 3: VAT LIEU — PHƯƠNG PHÁP.1 Vật liệu — Hóa chất - Dụng cụ - Trang thiết bị.2 Hóa chất, dụng CU.2 Cách tiếp cận và thiết kế nghiên cứu.----- - 2 2+ + E+EE£E+EeE£EzEerersrxsrree 43 3.1 Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy HSC in vifrO.1 Xây dựng quy trình phân lập HSC từ gan chuột BALB/c.1 Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy HSC in vitro .2 Đánh giá mối liên hệ và vai trò của sự tự thực bào trong sự hoạt hóa giai đoạn sớm HSC IN VIfFO .- cc c << E113 11111 88010303 11111110830 1 111k cv và 46 3.3: Tạo mô hình chuột tôn thương gan cấp tính và đánh giá trạng thái hoạt hóa ở lN)0/0/)//“H-----.4 Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân ức chế sự tự thực bào lên chuột mô hình và giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC itt VỉVO.3 Phuong phap thurc Wiém PhhyđềỎỞỈỎỎ.4 Trình bày dữ liệu và phân tích thống kê.---2¿-555c+cxerrrrrrrrrrrrrred 69 CHUONG 4: KET QUA - BIEN LUẬN.---- 5-52 522Ec2*+EczxeEcrtererxerrrerees 70 CÔN Ni an .1 Xây dựng quy trình phân lập tế bào hình sao gan từ chuột BALB/c.1 Khảo sát đường truyền dịch.2 Khảo sát enzyme ColÏagØ€TiaS€.- - - G11 ng kg re 74 4.3 Khảo sát nồng độ Nycodenz trong làm giàu HSC.4 Kết quả phân lập tế bào ứng viên từ quy trình xây dựng được.5 Quy trình chi tiết phân lập HSC từ gan chuột .2 Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy HSC in Vitro .1 Đặc tinh chất nền là Fibrin từ huyết tương.2 Mức độ hồi phục, khả năng tăng sinh và hình thái của HSC.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên chức năng HSC.4 Vai trò của gel Fibrin trong nuôi cấy HSC.--- ¿5 ccz+s+csczcx+z 92 iv LÊN G7 dd.1 Ảnh hưởng của LPS và CQ lên sự tăng sinh và hình thái của HSC in vitro.2 Ảnh hưởng của LPS và CQ lên sự biểu hiện collagen 6 HSC in vi/ro.3 Ảnh hưởng của LPS và CỌ lên sự biểu hiện ơ-sma ở HSC hoạt hóa in vitro 101 4.4 Ảnh hưởng của LPS va CQ lên chức năng dự trữ lipid ở HSC hoạt hóa in vitro .5 Tác động của CQ và LPS lên sự tự thực bào ở HSC hoạt hóa in vifro.6 Thao TUAn na.1 Tạo mô hình chuột tổn thương gan cấp tính.1 Mô hình chuột BDIL.-- ¿2 ¿+ 2©++S£+E+EE+E£EE2EEEEEEEEEErkerrrxererrerres 113 4.2 Mô hình chuột CCla .---¿- ¿25+ +2S++E+2EEE+EE+EE+EE2E+zEezxervervzrvrrves 116 4.3 Khao sát mức độ hoạt hóa va su tự thực bào ở HSC từ chuột tôn thương gan120 4.1 Sự hoạt hóa HSC trên mô hình chuột BDL.2 Sự hoạt hóa HSC trên mô hình chuột CC ]¿ .1 Ảnh hưởng của CQ lên chuột BDIL.1 Ảnh hưởng của CQ lên tình trạng bệnh lý chuột BDL.2 Anh hưởng của CQ lên sự hoạt hóa HSC trong gan chuột BDL.2 Ảnh hưởng của CQ trên chuột CCÌ.-- 2-2 2+ S2+E+E£2E£EEzE££EzEe£EzErxsree 134 4.1 Ảnh hưởng của CQ lên tình trạng bệnh lý chuột CC1¿.2 Ảnh hưởng của CQ lên sự hoạt hóa HSC trong gan chuột CCla.5 Tom lược kết quả của luận án. ---- - 2© k+S£SE+E£E£EEEEEEEEEEEEEEEErErkrrrrrreee 143 CHUONG 5: KET LUẬN - KIÊN NGHỊ,. 145 TÀI LIEU THAM KHẢO.--- 2-52 SSE‡EE£EE2EE2E2EEEEEEEEE121121171 711111111. 146 DANH MỤC BÀI BAO, CÔNG TRINH KHOA HỌC.--2- 2-52 255: 168 PHỤ LỤC vi TRANG THÔNG TIN LUẬN ÁN Tên đề tai luận án: Nghiên cứu sự hoạt hóa giai đoạn sớm in vitro va in vivo của tế bào hình sao gan trong mối quan hệ với sự tự thực Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 9420201 Họ tên nghiên cứu sinh: LÊ VĂN TRÌNH Khóa đào tạo: K29/2019 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trương Hải Nhung Cơ sở dao tạo: Truong Đại học Khoa học Tự nhiên, DHQG.

TOM TAT NỘI DUNG LUẬN ÁN: Xo hóa gan là kết qua chung của nhiều bệnh lý tổn thương gan. Trong đó, các tế bào gan bị chết và được thay thế bởi mô sẹo, có bản chất là sự tích tụ của. chất nên ngoại bào (ECM) tiết ra từ nguyên bào sợi cơ (MFB). Trong gan ton thuong, 80% nguồn gốc của MFB đã được chứng minh là từ tế bào hình sao gan (HSC), một loại tế bào của gan có chức năng dự trữ vitamin A.

Do đó, sự chuyền dạng hay hoạt hóa của HSC thành MEB khi gan ton thương được xem là bước then chốt trong tiến trình phát triển của bệnh lý xơ gan. Sự hoạt hóa HSC thành MFB được chia thành 2 giai đoạn là khởi đầu và duy trì. Khởi đầu là giai đoạn sớm trong sự hoạt hóa HSC chuyên từ trạng tháiim lặng sang trạng thái hoạt hóa. Các đặc trưng của HSC trong giai đoạn này gôm sự chuyên dang từ hình sao sang MFB, mat giọt lipid chứa vitamin A, biểu hiện các phân tử hoạt hóa như ơ- sma/collagen, hướng hóa động và tiết yếu tô viêm.

Giai đoạn duy trì trạng thai MFB với các đặc tính như tăng sinh mạnh, sản xuất ECM tạo xơ, vả di cư. Sự tự thực bảo là một con đường sinh lý nội bảo mới được phát hiện, giữ nhiều vai trò quan trọng trong tế bảo nhân thực, đặc biệt là giúp tế bào đáp ứng với điều kiện môi trường bắt lợi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung đánh giá mối liên hệ của sự tự thực bảo trong giai đoạn khởi đầu của sự hoạt hóa HSC in vitro và in vivo. Nghiên cứu gồm 4 nội dung: (1) Phân lập và nuôi cay HSC in vitro; (2) Đánh giá mối liên hệ và vai trò của sự tự thực bào trong sự hoạt hóa HSC in vitro ở giai đoạn sớm; (3) Tạo mô hình chuột ton thương gan cấp tính và đánh giá trạng thái hoạt hóa ở HSC in vivo; (4) Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân ức chế sự tự thực lên sự hoạt hóa HSC giai đoạn sớm in vivo ở chuột bi tôn thương gan cấp tính.

Các kết quả đã đạt được gồm: Nghiên cứu đã thiết lập được quy trình phân lập HSC sơ cấp từ gan chuột BALB/c và điều kiện nuôi cấy để duy trì kiểu hình im lặng in vitro bang giá thé Fibrin. Nghiên cứu ghi nhận sự tự thực bảo được cảm ứng biểu hiện từ giai đoạn sớm khi HSC hoạt hóa HSC in vitro bằng tác nhân lipopolysacharide, xử ly HSC với chat ức chế sự tự thực là Chloroquine 5 uM làm giảm sự hoạt hóa. Trên in vivo, sử dụng hai mô hình tốn thương gan cấp tính là tiêm 2 mL/kg CCl, và phẫu thuật thắt ống dẫn mật ở đối tượng chuột BALB/c. Nghiên cứu đã khảo sát được giai đoạn khởi đầu của sự hoạt hóa HSC ở hai mô hình này (sự hoạt hóa in vivo) là 2 ngày sau gây tôn thương.

Đồng thời, ghi nhận sự tăng biểu hiện của con đường tự thực bào trong HSC hoạt hóain vivo.