Nghiên cứu chế tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ và màng chân bì ứng dụng đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MÔ HÌNH THỎ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MÔ HÌNH THỎ NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH MÃ SỐ: 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trần Công Toại 2. Ngô Quốc Đạt Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2022 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN.i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT.ii DANH MỤC HÌNH.iv DANH MỤC BẢNG. vi MỞ ĐẦU.

4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Công nghệ mô sụn. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ. Giá thể sử dụng trong công nghệ mô sụn.

Yếu tố tăng trưởng trong công nghệ mô. Công nghệ tạo tấm tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào. Mô hình động vật trong đánh giá vật liệu ghép.

Các phương pháp đánh giá quá trình lành thương của mô sụn. Các nghiên cứu liên quan. 33 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết kế nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Quy trình nghiên cứu. Đạo đức nghiên cứu.

Phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ. Tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô mỡ thỏ và màng chân bì. Kết quả đánh giá tiềm năng tái tạo mô sụn in vivo của mảnh ghép tấm tế bào sụn trên mô hình thỏ. Phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ thỏ.

Tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô mỡ thỏ và màng chân bì. Bàn luận kết quả ghép tấm tế bào sụn trên mô hình thỏ. 91 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án Đặng Trần Quân ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT TIẾNG VIỆT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ BN Bệnh nhân CS Cộng sự TBG Tế bào gốc TBGTM Tế bào gốc trung mô TIẾNG ANH Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ADSC Adipose-derived Stem Cells Tế bào gốc từ mô mỡ BMSC Bone Marrow Stem Cells Tế bào gốc từ tủy xương Cell scraper Dụng cụ bóc tách tế bào Fibroblastic-Colony Forming Đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi CFU Units CM Conditioned medium Môi trường điều hòa Dulbecco's Modified Eagle DMEM/F12 Medium/Nutrient Mixture F-12 DMSO Dimethyl sulfoxide ECM Extracellular Matrix Chất nền ngoại bào EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EV Extracellular Vesicles Túi ngoại bào FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh phôi bò Flow cytometry Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy FDA Food and Drugs Aministration Cục quản lý thực phẩm và thuốc FGF Fibroblast growth factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi iii GMP Good Manufacturing Practices Thực hành sản xuất tốt HA Hyaluronic Acid Axit hyaluronic HBsAg Hepatitis B surface Antigen Kháng nguyên bề mặt viêm gan B HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C H&E Haematoxyline and Eosine Human Immuno-deficiency Virus gây suy giảm miễn dịch ở HIV Virus người IGF Insullin-like growth factor Yếu tố tăng trưởng giống insullin International Society for Cellular Hội liệu pháp Tế bào Quốc Tế ISCT Therapy International Organization for Tổ chức Quốc tế về Tiêu chuẩn hoá ISO Standardization PBS Phosphate Buffered Saline Đệm phốt phát PLA Processed lipoaspirate Real time Polymerase chain RT-PCR reaction SEM Scanning electron microscopy Kính hiển vị điện tử quét SAL Sterility assurance level Độ đảm bảo vô trùng TGF Transforming growth factor Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng iv DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.

Tiềm năng biệt hóa của TBGTM thu nhận từ mô mỡ 9 Hình 1. Hai giả thuyết về tái tạo sụn khớp liên quan đến tế bào gốc 12 Hình 1. Tiềm năng biệt hóa của TBGTM thành tế bào sụn 14 Hình 3. Hình ảnh phân lập mẫu mô mỡ 47 Hình 3.

Đồ thị sự tăng trưởng của tế bào thu nhận từ mô mỡ sau lần cấy chuyền thứ ba 49 Hình 3. Tế bào gốc bám dính trên bề mặt chai nuôi 50 Hình 3. Kết quả biệt hóa TBGTM từ mô mỡ thỏ in vitro 51 Hình 3. Đánh giá biểu hiện dấu ấn bề mặt của tế bào gốc từ mô mỡ thỏ 53 Hình 3.

Sự biểu hiện các gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2 khi cảm ứng biệt hóa tạo sụn 54 Hình 3. Kết quả thu nhận giá thể màng chân bì da người 56 Hình 3. Kết quả đánh giá độc tính của màng chân bì đối với TBGTM trong vòng 48 giờ nuôi cấy 57 Hình 3. Kết quả nuôi TBGTM trên màng chân bì 58 Hình 3.

Kết quả chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 7 sau biệt hóa tạo sụn 59 Hình 3. Kết quả chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 14 sau biệt hóa tạo sụn 59 Hình 3. Cấu trúc mô học nhuộm H&E của tấm tế bào sụn được cuộn TBGTM 2 lần 60 Hình 3. Cấu trúc mô học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào sụn sau khi chuyển TBGTM 1 lần 61 Hình 3.

Cấu trúc mô học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào v sụn sau khi chuyển TBGTM 2 lần 62 Hình 3. Tấm tế bào sụn quan sát dưới KHV điện tử quét (SEM) 63 Hình 3. Hình ảnh mổ ghép tấm tế bào sụn trên thỏ 65 Hình 3. Hình ảnh thu nhận mẫu ghép để đánh giá mô học 65 Hình 3.

Kết quả khảo sát mô học tấm tế bào sụn trên thỏ sau 1 tháng 68 Hình 3. Kết quả khảo sát mô học tấm tế bào sụn trên thỏ sau 2 tháng 70 Hình 3. Kết quả khảo sát mô học tấm tế bào sụn trên thỏ sau 3 tháng 72 Hình 3. Kết quả nhuộm Safranin O tấm tế bào sụn trên thỏ 73 Hình 4.

Kết quả đánh giá tiềm năng biệt hóa của TBGTM từ mô mỡ thỏ của tác giả Helena Debiazi Zomer và Tao-Chen Lee 76 Hình 4. So sánh kết quả thu nhận giá thể màng chân bì với các tác giả khác 81 Hình 4. Kết quả mô học tấm tế bào sụn từ sự kết hợp TBGTM mỡ và màng chân bì của tác giả Ken Ye và cộng sự. 84 vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.

Công cụ đánh giá sửa chữa sụn của Hiệp hội sửa chữa sụn quốc tế (ICRS) 25 Bảng 2. Danh sách các đoạn mồi khảo sát các gien đặc hiệu của TBGTM 37 Bảng 2. Danh sách các đoạn mồi khảo sát các gien tạo sụn 39 Bảng 3. Thống kê mật độ tế bào thu được trên các mẫu mô mỡ đã tiến hành phân lập 47 Bảng 3.

Sự tăng sinh của tế bào thu nhận từ mô mỡ 48 Bảng 3. Kết quả đánh giá biệt hóa TBGTM từ mô mỡ thỏ in vitro 52 Bảng 3. Đánh giá biểu hiện dấu ấn bề mặt của tế bào gốc từ mô mỡ thỏ 53 Bảng 3. Tóm tắt một số đặc điểm của thỏ trong quá trình nghiên cứu 66 Bảng 3.

Thỏ bị hủy ghép 67 Bảng 4. So sánh sự biểu hiện các dấu ấn đặc hiệu của TBGTM từ mỡ thỏ bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy của các tác giả nước ngoài 77 1 MỞ ĐẦU Hiện nay, tỷ lệ mắc các bệnh lý về khớp đang ngày càng tăng. Những nguyên nhân làm tổn thương lớp sụn đầu khớp như thoái hóa khớp, chấn thương thể thao, thói quen sinh hoạt … [160]. Trên thế giới có khoảng 263 triệu người gặp tình trạng thoái hóa khớp [77] và khoảng 20% người trưởng thành từ 45 tuổi ở Mỹ được chẩn đoán bằng X-quang [95].

Tại Việt Nam, tỷ lệ lưu hành bệnh thoái hóa khớp gối trên X- quang là 44,6% ở người trên 40 tuổi [6]. Những bệnh về khớp không chỉ gặp ở những người lớn tuổi mà còn gặp ở các đối tượng trung niên và thanh niên, gây ảnh hưởng tới khả năng vận động cũng như giảm đáng kể chất lượng cuộc sống của người bệnh [11]. Cấu trúc mô học của sụn khớp có tới 80% là nước, không có mạch máu, dây thần kinh và bạch huyết và chỉ có một loại tế bào sụn, dẫn đến mô sụn này có khả năng sửa chữa nội tại rất hạn chế. Các phương pháp điều trị bệnh hiện nay chủ yếu là điều trị triệu chứng.

Trong những trường hợp tổn thương nặng hoặc điều trị nội khoa không hiệu quả thì phẫu thuật thay khớp thường được lựa chọn. Phẫu thuật thay khớp gối là một phẫu thuật lớn nên cũng có nhiều biến chứng và việc thay khớp gối nhân tạo cũng có hạn chế là tuổi thọ của mảnh ghép thường từ 10-15 năm phải mổ lại để thay mới, đặc biệt bất lợi trên những bệnh nhân trẻ tuổi. Hiện nay để cải thiện và nâng cao chất lượng điều trị, các bác sĩ lâm sàng đã lựa chọn nhiều phương pháp khác nhau như tiêm nội khớp, kích thích mọc sụn bằng tạo tổn thương dưới sụn [141] hay liệu pháp tế bào gốc hoặc ghép tế bào sụn tự thân [29] để điều trị nhằm phục hồi sụn khớp, làm chậm quá trình thoái hóa, và kéo dài thời gian phải thay khớp. Các kết quả của các kỹ thuật điều trị này thường giảm hiệu quả theo thời gian do mô sụn bị xơ hóa dẫn đến cứng khớp sụn [112] hoặc mô ghép sụn thiếu sự gắn kết giữa mô chủ và mô ghép [155] làm kết quả ghép không đạt hiệu quả cao.

Các kỹ thuật ghép dựa trên tế bào dần cho thấy có vai trò ưu việt, trong đó, tế bào gốc trung mô (TBGTM) đã nổi lên như là một lựa chọn đầy hứa hẹn để điều trị các tổn thương sụn khớp và các giai đoạn viêm khớp ban đầu [91]. TBGTM là những tế bào gốc đa tiềm năng, có thể biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau bao gồm cả tế 2 bào sụn, có khả năng tự tái tạo, tính mềm dẻo cao, khả năng ức chế miễn dịch và chống viêm [62], [108]. Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu ban đầu về tiềm năng sử dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh thoái hóa khớp gối [25], [26], [158]. Kết quả cho thấy thử nghiệm lâm sàng ứng dụng TBGTM từ mỡ tự thân đang mở ra một hướng điều trị ít xâm hại cho bệnh thoái hóa khớp, giúp cải thiện tốt tình trạng lâm sàng và chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.