Luận án tiến sĩ: Xác định hàm lượng fucoidan trong polysaccharide tách chiết từ rong nâu bằng amin bậc 4 quaternary ammonium

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của TS.Nguyễn Duy Nhứt có tham khảo thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn này. Tác giả luận văn Võ Thị Như Trim luan an ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, trước tiên Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo viện, các nhà khoa học, anh chị em và bạn bè đang công tác tại Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy TS.Nguyễn Duy Nhứt – là người thầy bằng cả tâm huyết của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu, tận lực giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi và hỗ trợ hầu hết kinh phí để tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm công tác nghiên cứu tại Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt quá trình làm luận văn tại Viện. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của các anh, chị công tác tại Trung tâm Ứng dụng công nghệ - Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện chia sẽ, giúp đở tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè tôi, đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn và động viên để tôi hoàn thành luận văn này.

Tác giả luận văn Võ Thị Như Trim luan an 1 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. 1 DANH MỤC HÌNH. 4 DANH MỤC BẢNG.

6 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT. 8 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ RONG BIỂN. Phân loại rong biển.

Ứng dụng của rong biển. PHÂN BỐ RONG NÂU TẠI VIỆT NAM. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RONG NÂU. GIỚI THIỆU VỀ FUCOIDAN.

Lịch sử phát hiện và cấu trúc fucoidan. Hoạt tính fucoidan. Một số sản phẩm fucoidan trên thế giới và công dụng ghi trên bao bì. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan.

MỘT VÀI PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT FUCOIDAN. Phương pháp chiết theo Black. Phương pháp chiết của Wan Aida Wan và cộng sự. Một số phương pháp chiết sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc fucoidan.

Phương pháp chiết Soyoung Yang và cộng sự (2011). Phương pháp tinh chế fucoidan:. MỘT VÀI PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FUCOIDAN. Xác định hàm lượng fucoidan trong rong nâu bằng phương pháp phân tích khối lượng.

Phương pháp xác địnhhàm lượng fucoidan thông qua hàm lượng fucose. Phương pháp của Usov và cộng sự. Phương pháp của Bùi Minh Lý và cộng sự. Phương pháp định lượng fucoidan bằng phương pháp huỳnh quang của U.

Phương pháp sử dụng điện cực màng polyion độ nhạy cao của Ji Min Kim và cộng sự. 42 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. Các hóa chất sử dụng.

Phần mềm xử lý dữ liệu. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Dịch chiết polysaccharide rong nâu. Phương pháp phân tích khối lượng.

Ký hiệu mẫu và các sản phẩm trung gian trong phương pháp kiểm. Xác định hàm lượng fucoidan dựa vào xác định hàm lượng fucose. Xây dựng đường chuẩn methylpentose. Xác định hàm lượng fucose trong một số loài rong nâu phổ biến ở khánh hòa bằng phương pháp so màu.

Xác định hàm lượng fucose trong một số loài rong nâu phổ biến ở khánh hòa bằng phương pháp sắc kí khí (GC). Phương pháp chuẩn độ kết tủa. 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ĐỊNH LƯỢNG FUCOIDAN TRONG 6 LOÀI RONG NÂU THU THẬP TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH KHÁNH HÒA DỰA VÀO PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHỐI LƯỢNG.

HÀM LƯỢNG FUCOIDAN TRONG 6 LOÀI RONG NÂU Ở KHÁNH HÒA DỰA VÀO PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FUCOSE. Xác định hàm lượng fucoidan dựa vào hàm lượng fucose trong rong, fucoidan tinh chế và trong dịch chiết một số loài rong nâu phổ biến ở khánh hòa bằng phương pháp so màu dische z. Xác định hàm lượng fucoidan dựa vào hàm lượng fucose trong rong, fucoidan tinh chế và trong dịch chiết một số loài rong nâu phổ biến ở khánh hòa bằng phương pháp sắc kí khí (GC). XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FUCOIDAN TRONG DỊCH CHIẾT RONG BẰNG QUATERNARY AMMONIUM DẠNG LỎNG.

70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 83 luan an 4 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình thái rong Lục.

Hình thái rong Nâu. Hình thái rong Đỏ. Phân tử alginic axít (G: guluronic axít, M: mannuronic axít). Cấu trúc của laminaran.

Cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus mô tả vào năm 1950. Cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum. Cấu trúc fucoidan từ Fucus evanescens. Cấu trúc fucoidan từ Fucus distichus.

Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus. Sơ đồ chiết fucoidan của Nora M. Sơ đồ chiết tinh chế các thành phần của polysaccharide trong rong nâu. Phản ứng alginate kết tủa với Ca2+.

Fucoidan phản ứng với cetavlon. Phản ứng fucoidan được giải hấp khỏi cetavlon. Sơ đồ phản ứng tạo màu của L-fucose và L-cystein. Sơ đồ phản ứng xác định thành phần các gốc đường của fucoidan.

Mẫu rong Sargassum oligocystum và Sargassum swatzii. Mẫu rong Sargassum mcclurei và Sargassum duplicatum. Mẫu rong Turbinaria ornate và Hormophys articulata. Sơ đồ qui trình chiết tối ưu theo Soyoung Jang và cộng sự (2011).

Sơ đồ tinh chế fucoian từ dịch chiết rong (dd Mi). 49 luan an 5 Hình 2. Sơ đồ xác định hàm lượng fucoidan dựa vào hàm lượng fucose bằng phương pháp so màu Dische Z. Sơ đồ phân tích xác định các alditol acetat.

Biểu đồ so sánh hàm lượng fucoian trong các loài rong xác định bằng phương pháp phân tích khối lượng. Đường chuẩn methylpentose. Sắc ký đồ GC của glucose được acetyl hoá trực tiếp. Sắc ký đồ GC của các mẫu đường chuẩn.

68 luan an 6 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Thành phần hoá học (trên 100g rong) của một số loài rong trong 3 ngành chính. Thành phần chính của sản phẩm chiết thô. Tác dụng của nồng độ etanol lên dịch chiết rong.

Kết quả hàm lượng fucoidan tính theo khối lượng fucoidan thu được bằng phương pháp chiết trên khối lượng rong khô. Kết quả phân tích dữ liệu so sánh sự khác biệt về hàm lượng fucoidan trong rong giữa các loài rong ở bảng 3. Hàm lượng Fucoidan xác định dựa vào hàm lượng fucose (tính theo phương pháp so màu) trong 6 mẫu rong tính từ rong thu thập tại vùng biển Khánh Hòa. Hàm lượng Fucoidan xác định dựa vào hàm lượng fucose (tính theo phương pháp so màu) trong rong tính từ dịch chiết rong 6 loài rong thu thập ở vùng biển Khánh Hòa.

Kết quả phân tích dữ liệu so sánh sự khác biệt giữa hàm lượng fucoidan trong rong tính từ rong và fucoidan trong rong tính từ dịch chiết rong của cùng một loài rong thu được ở bảng 3. Hàm lượng fucoidan trong dịch chiết rong từ 6 loài rong xác định dựa vào phương pháp sắc kí khí GC. Hàm lượng fucoidan tính trên khối lượng rong khô đem chiết xác định bằng phương pháp chuẩn độ kết tủa. Kết quả hàm lượng fucoidan tính theo khối lượng rong đem chiết được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau.

71 luan an 7 Bảng 3. Các kết quả phân tích dữ liệu sử dụng phần mềm GrapthPad để so sánh kết quả hàm lượng fucoidan trong dịch chiết được định lượng bằng phương pháp phân tích khối lượng (phương pháp chiết-tinh chế) và phương pháp xác định hàm lượng fucoidan dựa vào hàm lượng fucose trên cùng một loài rong. Các kết quả phân tích dữ liệu sử dụng phần mềm GrapthPad để so sánh kết quả hàm lượng fucoidan trong dịch chiết được định lượng bằng phương pháp phân tích khối lượng (phương pháp chiết-tinh chế) và phương pháp chuẩn độ kết tủa với cetavlon trên cùng một loài rong. 72 luan an 8 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AIDS : Acquired immune deficiency syndrome.

Da : Dalton FDA : Food and Drug Administration fuc : L-fucose gal : D-galactose GC : Gas chromatography HIV : Human immunodeficiency virus HPLC : High Performance Liquid Chromatography Cetavlon : Hexadecyltrimethylammonium bromide MWCO : Moleculare weight cut off PLC : Performance Liquid Chromatography S : Sargassum TFA : Trifluoroacetic UV-VIS : Utralviolet- Visible WHO : World Health Organization DT : Diện tích HGF : Hepatocyte growth factor Ac2O : Acetic anhydrit luan an 9 MỞ ĐẦU Fucoidan là tên được dùng để đặt cho một dạng anion polysaccharide trong rong nâu (một số động vật thân mềm sử dụng rong nâu làm thức ăn có thành phần sulfate fucans trong cơ thể chúng, tuy nhiên cấu trúc những sulfate fucan này đơn giản, là mạch thẳng và chỉ có fucose trong thành phần đường). Rong nâu đã được dùng như thực phẩm và thuốc từ cách đây 3000 năm ở Tonga và ít nhất là 2000 năm tại Trung Hoa. Tuy nhiên đến 1913 Kyllin mới xác định và mô tả. Gần đây, việc tìm kiếm các loại thuốc mới đã làm tăng sự quan tâm đến Fucoidan và các phương pháp định lượng Fucoidan.

Sau rất nhiều nghiên cứu về fucoidan, dựa vào các công trình đã được công bố, có thể đưa ra khái niệm, fucoidan là một polysaccharide sulfate hoá dị hợp trong mạch có chứa fucose, ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như Galactose, Glucose, Mannose. Xylose, Rhamnose…và acid uronic. Do vậy, việc mô tả cấu trúc hoàn chỉnh và đưa ra phương pháp định lượng chính xác fucoidan rất khó khăn. Fucoidan đã được tập trung nghiên cứu rất nhiều trên thế giới cũng như ở Việt Nam.

Nhiều sản phẩm phục vụ sức khỏe cộng đồng đã được sản xuất đưa ra thị trường, tuy nhiên một phương pháp kiểm định lượng thống nhất cho fucoidan từ tất cả các loài rong nâu, không mang tính qui đổi từ chuẩn sang mẫu (vì chúng khác nhau), cho đến nay vẫn chưa được đưa ra.