Luận án nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase loài Thạch tùng (Lycopodiaceae) - Đại học Dược Hà Nội

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án i MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT. iii DANH MỤC BẢNG. iv DANH MỤC HÌNH.

vi DANH MỤC SƠ ĐỒ. viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ. viii MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC.

TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC. CÁC PHƯƠNG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÁP PHÂN TÍCH HUPERZIN A. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE.

CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM VỀ TRÍ NHỚ. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỌ THẠCH TÙNG. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU.

QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. XÁC ĐỊNH CÁC BIẾN SỐ.

DUNG MÔI - HÓA CHẤT - TRANG THIẾT BỊ. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC.

TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CZE VÀ HPLC.

NGHIÊN CỨU IN VIVO TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA THẠCH TÙNG NGHIÊN. VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC. VỀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG. VỀ MẶT HÓA HỌC.

VỀ MẶT THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU. VỀ MẶT XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC LIỆU. VỀ MẶT THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC .132 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AChE Acetylcholinesterase AD Alzheimer's Disease Bệnh Alzheimer's BuChE Butylcholinesterase CC Column Chromatography Sắc ký cột COSY Correlation Spectroscopy DCM Dicloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam Distortionless Enhancement by DEPT Polarization Transfer DTNB 5,5ʹ-dithio-bis-nitro benzoic EtOAc Ethyl acetat Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thực phẩm FDA dược phẩm Hoa Kỳ HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC High Pressure Liquid Chromatography Sắc ký lỏng cao áp HRMS High Resolution Mass Spectrometry Khối phổ phân giải cao Heteronuclear Multiple Quantum HSQC Correlation IC Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế IR Infrared Hồng ngoại MS Mass Spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Ultraviolet Tử ngoại Primary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học sơ PCRS cấp Secondary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học thứ SCRS cấp LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Nguyên liệu nghiên cứu.

Thành phần một mẫu thử nghiệm theo phương pháp Ellman. Đặc điểm hình thái khác nhau của các chi trong họ Thạch tùng. Kết quả xác định độ ẩm cao chiết MeOH và hiệu suất chiết các dược liệu. Kết quả tác động ức chế AChE của mẫu thử nghiệm.

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật. Kết quả so sánh 2 quy trình phân lập alcaloid. Các phân đoạn của cột Diaion HP-20. Các phân đoạn của cột sắc ký MeOH 100 %.

Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 1. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 2. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 3. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 4.

So sánh kết quả của PP1, PP2, PP3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 6. Kết quả tác động ức chế AChE của các hợp chất phân lập được.

Các phân đoạn của cột R-1. Các phân đoạn của cột R-2. Kết quả khảo sát hàm ẩm và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết. Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết sắc ký của huperzin A.

Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu thiết lập CĐC. Kết quả phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA. Kiểm tra tính phù hợp hệ thống và kết quả xác định hàm lượng huperzin A tại 2 phòng thí nghiệm (n = 6). Xác định giá trị công bố.

Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử. Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong Thạch tùng răng. Tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của huperzin A.

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng huperzin A. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn huperzin A. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong Râu rồng. Kết quả tính toán hàm lượng huperzin A trong cây Râu rồng.

Tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của huperzin A. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng. Kết quả xác định hàm lượng huperzin A của 10 loài trong họ Thạch tùng. Các hệ thống phân loại họ Thạch tùng .107 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.

Cấu trúc của bốn nhóm Lycopodium alcaloid. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycodin. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycopodin. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung fawcettimin.

Cấu trúc của một số Lycopodium alcaloid trong cây Thạch tùng răng. Cấu trúc của một số acid phenolic được phân lập từ loài Lycopodium clavatum. Cấu trúc một số terpenoid được phân lập từ loài Lycopodium japonicum. Cấu trúc của một số flavonoid trong chi Lycopodium.

Cấu trúc của một số alcaloid trong cây Thạch tùng nghiên. Cấu trúc của huperzin A. Các loài Thạch tùng nghiên cứu. So sánh đặc điểm vi phẫu rễ của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 56 Hình 3.

So sánh đặc điểm vi phẫu thân của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng. So sánh đặc điểm vi phẫu lá của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 58 Hình 3. Sắc ký đồ dịch chiết alcaloid từ quy trình 1 và quy trình 2. Sắc ký đồ các phân đoạn MeOH 100 %.

Công thức cấu tạo của huperzin A. Công thức cấu tạo của một số hợp chất khung cấu trúc Phlegmariurin B 68 Hình 3. Công thức cấu tạo của hợp chất 2 (Lycosquarosin A). Các tương tác xa của hợp chất 2 (lycosquarosin A).

Công thức cấu tạo của acetylaposerratinin. Công thức cấu tạo của huperzinin. Sắc ký đồ các phân đoạn alcaloid. Sắc ký đồ các phân đoạn cột Diaion.

Công thức cấu tạo của lycocernuin. Khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid. Cấu trúc hóa học và các tương tác của lycocernuasid A. Sắc ký đồ các phân đoạn cột R-1.

Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn huperzin A. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát dung dịch đệm. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát nồng độ dung dịch đệm. Khảo sát nồng độ đệm đến (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển, (c) thời gian xuất hiện pic chuẩn nội.

Điện di đồ của mẫu thử khảo sát sự ảnh hưởng của pH. Khảo sát pH theo độ phân giải (a) và theo cường độ dòng (b). Điện di đồ của mẫu thử khảo sát điện thế. Khảo sát điện thế theo (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển.

Diện di đồ của mẫu thử khảo sát phương pháp chiết. Điện di đồ mẫu thử chiết huperzin A trong Thạch tùng răng bằng MeOH lần thứ 4. Phổ UV huperzin A trong mẫu thử và mẫu chuẩn. Điện di đồ các mẫu trắng (a), chuẩn (b), thử (c), thử thêm chuẩn (d).

Đồ thị tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của huperzin A. Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn khảo sát pha động MeOH - acid phosphoric 0,1 % (18:82). Sắc ký đồcủa mẫu thử khảo sát dung môi chiết. Sắc ký đồ dịch chiết MeOH lần thứ 4 của mẫu thử.

Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn khảo sát tính chọn lọc. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của huperzin A. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia phlegmaria. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia carinata.

Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia fordii. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia tetrasticha. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia serrata. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium complanatum.

Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium clavatum. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium casuarinoides. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodiella cernua. Công thức cấu tạo của huperzin A và huperzinin.

Công thức cấu tạo của lycosquarosin A và acetylaposerratinin .117 viii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. Vị trí phân loại của Lycopodiaceae………………………………………. Quy trình nghiên cứu. Sơ đồ thử nghiệm mô hình mê cung bơi.

Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Râu rồng. Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Thạch tùng nghiên .74 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. Kết quả thử nghiệm tránh né thụ động (n = 5). So sánh thời gian chuột tìm đến chân đế (n = 5).

So sánh thời gian chuột bơi trong vùng có chân đế (n = 5).105 1 MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer là một chứng suy giảm trí nhớ phổ biến nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến cuộc sống của người lớn tuổi. Vì bệnh không thể chữa khỏi, người bệnh cần được chăm sóc bởi người thân. Đây quả thực là áp lực rất lớn về mặt xã hội, tâm lý, sức khỏe, kinh tế đối với cuộc sống của những người trong gia đình. Do đó, bệnh Alzheimer trở thành một thách thức lớn cho xã hội trong thế kỷ này [21] [95] [111].

Alzheimer được xem như một triệu chứng của quá trình lão hoá mà đặc trưng của bệnh là sự suy thoái trí nhớ và sự mất trí nhớ toàn bộ xảy ra khi bệnh tiến triển. Những nghiên cứu về căn bệnh đã xác định mối tương quan đáng kể giữa sự hiện diện của chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholin, vốn cần cho việc hình thành và lưu giữ trí nhớ, với sự tiến triển của bệnh Alzheimer. Acetylcholin tồn tại càng lâu trong não thì các tế bào não có thể gợi nhắc trí nhớ càng lâu. Ngày nay, phương pháp hiệu quả nhất là sử dụng các chất có tác dụng ức chế acetylcholinesterase như tacrin, donepezil, galantamin và rivastigmin [33] [94] [112].