Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm ngọc linh và khảo sát ảnh hưởng của elicitor

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------------------------------- NGUYỄN THỊ NHẬT LINH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH LÝ HỌC THỰC VẬT HUẾ - Năm 2017 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------------------------------- NGUYỄN THỊ NHẬT LINH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62.12 Người hướng dẫn khoa học: 1. Dương Tấn Nhựt 2. Nguyễn Hoàng Lộc HUẾ - Năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án: “Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin” là công trình nghiên cứu của tôi được trợ giúp của các cộng sự dưới hướng dẫn của GS. Dương Tấn Nhựt và GS.

Nguyễn Hoàng Lộc. Luận án được hỗ trợ kinh phí và điều kiện trang thiết bị từ các đề tài của phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, cùng với sự hỗ trợ của Trung tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh và Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế. Các số liệu trong luận án này cũng là một phần kết quả của các đề tài đã và đang thực hiện tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Tôi xin cam đoan những kết quả và số liệu trong luận án này hoàn toàn trung thực và chưa được công bố dưới bất kỳ hình thức nào.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Nhà trường về lời cam đoan này. Đà Lạt, ngày 07 tháng 09 năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Nhật Linh ii LỜI CẢM ƠN Trong biển kiến thức bao la, tôi đã thực sự tìm được con thuyền lớn để theo đuổi đam mê nghiên cứu khoa học. Với vai trò đầu tàu, Thầy, GS. Dương Tấn Nhựt đã chèo lái, hướng dẫn và giúp đỡ biết bao nhiêu thế hệ sinh viên tiến đến với ước mơ và gặt hái thành công trong cuộc sống và trên con đường nghiên cứu khoa học phục vụ cho sự phát triển của nước nhà.

Cảm ơn Thầy luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, cũng như không ngừng giúp đỡ để tôi hoàn thành được luận án này. Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy GS. Nguyễn Hoàng Lộc đã gợi ý và chỉ dẫn những hướng mới cho nghiên cứu, cũng như đã luôn nhắc nhở để tôi hoàn thành tốt chương trình học và luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý Thầy, Cô Khoa Sinh học và phòng Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua.

Xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các cô chú, anh chị tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên và Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh đã cho tôi cơ hội thực hiện nghiên cứu tại đây. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn các anh, chị Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống Cây trồng đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong thời gian qua. Tôi xin cảm ơn anh Nam, anh Luận, anh Huy, chị Hiền, chị Phượng, Tùng và Chiến đã tận tình giúp đỡ tôi như những người thân trong gia đình. Thời gian gặp tuy ngắn ngủi nhưng các bạn sinh viên, học viên thực tập tại Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên và Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế đã cho tôi ấn tượng rất sâu sắc bởi lòng nhiệt tình với công việc của các bạn và đã tạo cho tôi nhiều niềm phấn khởi để thực hiện tốt luận án.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn trong thời gian qua. Để có thể hoàn thành tốt luận án này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến anh Thức, anh Hiếu, Kim Cương, Văn Cương và Tâm luôn sát cánh bên tôi và không ngừng hỗ trợ và giúp đỡ tôi mặc cho những khó khăn và cách trở. Dù có khó khăn hay thất bại và đôi lúc nản lòng, gia đình cũng luôn là điểm tựa vững chắc giúp con vượt qua những khó khăn và thử thách trong cuộc đời. Con xin cảm ơn Bố, Mẹ, những người Thầy đầu tiên, đã dìu dắt con vào đời, và cho dù khó nhọc đến đâu nhưng vẫn luôn luôn tạo cho con những điều kiện tốt nhất để không thua kém với bạn bè cùng trang lứa.

Con xin cảm ơn cả nhà đã luôn luôn ủng hộ, động viên và đỡ đần cho con! Đà Lạt, ngày 09 tháng 07 năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Nhật Linh iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. x DANH MỤC BẢNG .xi DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ. xiii ĐẶT VẤN ĐỀ.

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH. Nguồn gốc và lịch sử phát triển. Đặc điểm hình thái và sinh trưởng.

Đặc điểm phân bố. Đặc điểm đa dạng di truyền. SƠ LƯỢC VỀ CÁC HỢP CHẤT SAPONIN. Cấu trúc của các saponin có trong sâm Ngọc Linh.

Các tính chất hóa lý của các saponin trong sâm Ngọc Linh. Vai trò của saponin trong cây. Con đường tổng hợp các triterpene saponin. NUÔI CẤY IN VITRO SINH KHỐI RỄ BẤT ĐỊNH VÀ RỄ THỨ CẤP.

Khái niệm về rễ bất định. Khái niệm về rễ thứ cấp. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ thứ cấp và rễ bất định. Loại mẫu cấy.

Vị trí phát sinh. Vai trò điều hòa của auxin. Tương tác giữa auxin và cytokinin. Giá thể nuôi cấy.

Các hệ thống nuôi cấy. Một số nghiên cứu nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ các loài sâm. Một số nghiên cứu trên thế giới. Một số nghiên cứu trong nước về rễ bất định sâm Ngọc Linh.

ELICITOR VÀ SỰ KÍCH KHÁNG TRONG NUÔI CẤY IN VITRO. Cơ chế tác động của các elicitor. Cách xử lý và tác động của elicitor. Thời gian tiếp xúc với elicitor.

Thời kỳ nuôi cấy. Thành phần dinh dưỡng. Một số elicitor phổ biến trong nuôi cấy nhân sâm. Dịch chiết nấm men.

Elicitor có nguồn gốc từ chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Ứng dụng elicitor trong nuôi các loài nhân sâm in vitro. 35 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.

Thiết bị, dụng cụ và hóa chất. Địa điểm và thời gian thực hiện luận án. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM. Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy rễ thứ cấp từ nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro.

Khảo sát ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình thành và tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp giữa auxin và cytokinin lên sự hình thành và tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành và tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro.

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3- trong môi trường MS lên sự hình thành và tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường carbohydrate lên sự hình thành và tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự hình thành và tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Tối ưu điều kiện nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh để tăng cường sự hình thành rễ thứ cấp và tích lũy saponin trong nuôi cấy in vitro.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của giai đoạn nuôi cấy tối và sáng lên sự tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro.

Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Tối ưu khả năng tích lũy saponin của rễ thứ cấp hình thành từ rễ bất định sâm Ngọc Linh nhờ tác động của các elicitor. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro.

Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro.

Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh in vitro. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý elicitor lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro. Phương pháp xác định chỉ số tăng trưởng, tỷ lệ chất khô, tỷ lệ hình thành và tăng sinh của mẫu cấy. Môi trường nuôi cấy.