Đánh giá dược liệu Bình Dương kháng MRSA - Luận án TS CN Sinh học (Mai Thị Ngọc Lan Thanh)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA MAI THỊ NGỌC LAN THANH ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA) CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THU HÁI TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA MAI THỊ NGỌC LAN THANH ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN (MRSA) CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THU HÁI TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG Chuyên ngành: Công Nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 62420201 Phản biện độc lập 1: PGS.

Phạm Thị Phượng Trang Phản biện độc lập 2: PGS. Trần Cát Đông Phản biện 1: PGS. Nguyễn Thị Thu Hoài Phản biện 2: PGS. Trần Hùng Phản biện 3: PGS.

Nguyễn Thúy Hương NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trương Vũ Thanh 2. Hoàng Anh Hoàng TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả.

Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định. Tác giả luận án Chữ ký Mai Thị Ngọc Lan Thanh i TÓM TẮT LUẬN ÁN Đề tài “Đánh giá đặc điểm kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của một số dược liệu thu hái tại tỉnh Bình Dương” được thực hiện từ tháng 12/2015 đến tháng 12/2020 tại bộ môn Công nghệ sinh học và Bộ môn Hóa Dược, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh; bộ môn Sinh học ứng dụng, khoa Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Thủ Dầu Một. Mục tiêu của đề tài là xác định được hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của cao ethanol thực vật/cao phân đoạn/tinh chất.

Nội dung của đề tài bao gồm: Sàng lọc hoạt tính kháng MRSA của cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn từ thực vật thu hái tại tỉnh Bình Dương; Đánh giá khả năng kháng khuẩn MRSA của cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn; Xác định công thức hợp lực giữa cao phân đoạn với kháng sinh, và công thức hợp lực giữa các cao phân đoạn với nhau; Xác định hoạt tính ức chế hình thành màng sinh học, hoạt tính ức chế tan huyết, hoạt tính ức chế PBP2a, ức chế khả năng chịu muối trên MRSA của cao phân đoạn; Xác định và phân tích hoạt tính của tinh chất chính từ cao ethanol toàn phần cho hoạt tính kháng MRSA tốt nhất. Kết quả đạt được như sau: Kết quả xác định được bốn cao chiết ethanol toàn phần từ Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke có hoạt tính kháng MRSA, trong đó cao ethanol toàn phần Trâm Tròn, Xăng Mã, Cò Ke được báo cáo lần đầu về hoạt tính kháng MRSA. Kết quả thử độc tính trên nguyên bào sợi và tế bào ung thư gan đã xác định tính an toàn của các cao chiết ethanol toàn phần Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke. Mục tiêu của luận án là xác định nhóm hoạt chất kháng MRSA, công thức hợp lực và đích tác động của nhóm hoạt chất kháng MRSA.

Kết quả của đề tài đã thu nhận được các cao phân đoạn ethylacetate của Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke cho hoạt tính kháng MRSA. Trong đó, cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn có giá trị MIC thấp nhất bằng 1 mg/mL. Phương pháp bàn cờ được sử dụng nhằm xác định chỉ số FIC của các cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke với kháng sinh, ii và giữa bốn cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke với nhau. Kết quả xác định cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn có khả năng hợp lực với kháng sinh cefoxitin, với công thức hợp lực là cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam ở nồng độ 0,812 mg/mL và cefoxitin ở nồng độ 0,002 mg/mL (1:1); Công thức hợp lực của cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn với cefoxitin là cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn ở nồng độ 0,500 mg/mL và cefoxitin 0,008 mg/mL (1:1).

Tuy nhiên, chỉ có cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn thể hiện sự hợp lực với vancomycin, với công thức hợp lực là cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn ở nồng độ bằng 0,24 mg/mL và vancomycin có nồng độ bằng 0,001mg/mL (1:1). Các kết quả từ phương pháp nhuộm với crystal violet và chụp ảnh SEM đã chỉ ra rằng, cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam ở nồng độ bằng 0,4062 mg/mL và cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn ở nồng độ bằng 0,2500 mg/mL ức chế hình thành màng sinh học trên chủng MRSA. Ảnh chụp SEM xác định hình thái tế bào MRSA trong màng sinh học thay đổi khi xử lý với hai cao phân đoạn này. Thử nghiệm khả năng chịu muối, xác định vách tế bào là đích tác động của cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam vì phần trăm tế bào MRSA sống sót so với đối chứng giảm 58,89%.

Sử dụng phương pháp nuôi trên môi trường thạch máu nhằm xác định khả năng ức chế độc tính tan huyết của chủng MRSA khi tiếp xúc với dung dịch khảo sát. Kết quả xác định cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã ức chế hoàn toàn khả năng tan huyết của chủng MRSA ở nồng độ 4 mg/mL. Mục tiêu của luận án là xác định cấu trúc tinh chất chính, công thức hợp lực và cơ chế kháng MRSA. Kết quả thu nhận được bốn tinh chất từ cao ethanol toàn phần Trâm Tròn là pinostrobin, 4-methoxy benzoic acid, dimethyl pinocembrin, acid betulonic.

Trong đó, lượng pinostrobin được tìm thấy nhiều nhất với hiệu suất chiết là 12,79 ± 0,21 mg pinostrobin/ 1g bột lá khô, dimethyl pinocembrin lần đầu tiên được tách chiết từ chi Trâm. Công thức hợp lực của pinostrobin và vancomycin là pinostrobin ở nồng độ bằng 12,8 µg/mL và vancomycin ở nồng độ bằng 0,5 µg/mL (1:1). iii ABSTRACT The thesis title: “Evaluation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) characteristics of some medicinal herbs collected in Binh Duong province” was carried out at the Department of Biotechnology, the Department of Chemistry- Faculty of Chemical Engineering, Ho Chi Minh City University of Technology, the Department of Applied Biology, Thu Dau Mot University from December 2015 to December 2019. The main purpose of this study is to collect the ethanol plant extracts/fractions/main pured compounds which have anti-MRSA activity.

The content of the topic includes: Screening the ethanol plant extracts are collected in Binh Duong province and evaluation of anti-MRSA activity of ethanol plant extracts and fractions; the fractions of ethanol plant extracts are collected, which are evaluated the anti- MRSA activity of these fractions, simultaneous assessment of the mechanism of antibacterial activity of fractions; The main pure compound is isolated from ethanol plant extract which has the most anti-MRSA activity. The synergistic formula of main compound with antibiotic is determined. The results are as follows: There are four plant species, including Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium glomeratum, Grewia asiatica L had been identified with anti-MRSA activity. Among them, ethanol extracts of Carallia brachiata, Syzygium glomeratum, Grewia asiatica L were reported anti-MRSA activity the first time.

The Sulforhodamine B assay is carried out for testing toxicity of ethanol plant extracts on fibroblast cells and hepatocyte cells. The results present that Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium glomeratum, Grewia asiatica L ethanol extracts are safe. The ethylacetate fractions of Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium glomeratum, Grewia asiatica L leaf extracts are collected for testing anti-MRSA activity. Especially, ethylacetate Syzygium glomeratum fraction has the lowest MIC value of 1mg/mL.

The checkerboard method was undertaken to determine synergistic interactions of plant extracts and isolated pure compounds in combination with antibiotic and the four iv ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium glomeratum, Grewia asiatica L extracts together demand for FICIs. The results shown that two ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense, Syzygium glomeratum extracts can synergize with cefoxitin. The synergistic formulation of ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense extract and cefoxitin is 0.812 mg/mL (NN Ea) and 0.002 mg/mL (cefoxitin) (1:1); the synergistic formulation of the ethylacetate of Syzygium glomeratum extract is 0.500 mg/mL (SCTT Ea) and 0.008 mg/mL (cefoxitin) (1:1), respectively. However, only the ethylacetate of Syzygium glomeratum extract is determined the synergistic activity with vancomycin.

The synergistic formulation of the ethylacetate of Syzygium glomeratum extract and vancomycin is 0.24 mg/mL (SCTT Ea) and 0. The results from crystal violet assay and SEM technique have shown that ethylacetate Cratoxylum cochinchinense fraction at a concentration of 0.4062 mg/mL and ethyl acetate Syzygium glomeratum fraction at a concentration of 0.2500 mg/mL, which inhibited the biofilm formation on MRSA. SEM images are collected, which presented the change of morphologies of MRSA cells inside the biofilm when MRSA had been treated with these two fractions. The salt tolerance test was undertaken to identify damage to the cell wall on MRSA.

The results show that MRSA cells are treated with the ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense extract, which decreased the surviving of MRSA cells on high salt concentrated medium. The MRSA cultured blood agar method was carried out to determine the ability to inhibit hemolytic toxicity of MRSA strains when MRSA cells were treated with the ethylacetate of plant extracts or pinostrobin. The results showed that the ethylacetate of Carallia brachiata extract completely inhibited the hemolytic ability on the MRSA strain at a concentration of 4 mg/mL. In this research, four pure compounds are isolated from the Syzygium glomeratum ethanol extract, which are pinostrobin, 4-methoxy benzoic acid, dimethyl pinocembrin, betulonic acid.

Among them, the amount of pinostrobin was highest with an extraction yield of v 12.21 mg of pinostrobin in 1 g of dried leaf powder, dimethyl pinocembrin is the first isolated from the genus Syzygium. The synergistic formulation of pinostrobin and vancomycin is 12. vi LỜI CÁM ƠN Tôi xin trân trọng gửi lời biết ơn sâu sắc đến PGS. Trương Vũ Thanh và TS.

Hoàng Anh Hoàng là hai người thầy đã hướng dẫn tận tình, chỉ bảo cho tôi hoàn thành Luận Án. Đặc biệt, Tôi xin kính dâng lòng biết ơn của tôi cho người thầy đã giúp tôi định hướng và giúp đỡ tôi rất nhiều cũng như động viên cho tôi vượt qua rất nhiều khó khăn để có ngày hôm nay, đó chính là người thầy PGS.TS Lê Phi Nga. Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình đã luôn ủng hộ, giúp đỡ về vật chất cũng như tinh thần để tôi yên tâm hoàn thành Luận Án. Tôi chân thành cám ơn đến Lãnh đạo Đại học Thủ Dầu Một, Thầy cô Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Phòng sau đại học Bách Khoa TP.HCM và các đồng nghiệp đã cung cấp tài liệu, tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu hoàn thành Luận Án và đóng góp ý kiến.

Đặc biệt, tôi xin gửi lời đến TS. Nguyễn Thị Nhật Hằng, chị luôn ủng hộ và tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu, học tập, làm việc. Tôi cám ơn các bạn sinh viên, các đồng chí, đồng đội luôn sát cánh bên tôi, đặc biệt cám ơn bạn Trần Thị Mai Thy đã luôn ủng hộ tinh thần cũng như vật chất.