Luận án tiến sĩ xác định đặc điểm vi sinh Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ mở rộng tại huyện Vũ Thư, Thái Bình

i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của nhiều Cơ quan, tập thể và cá nhân. Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ƣơng, Trung tâm Đào tạo và Quản lý Khoa học, Bộ môn Vi sinh đã luôn tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Trung tâm Dịch vụ Khoa học Kỹ thuật Y Dƣợc - Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thái Bình, Khoa vi khuẩn - Viện vệ sinh Dịch tễ Trung Ƣơng, Viện Y tế công cộng phủ Osaka- Nhật Bản đã cho phép tôi đƣợc sử dụng các trang thiết bị máy móc, hỗ trợ kỹ thuật và tạo điều kiện, môi trƣờng nghiên cứu tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu, hoàn thành luận án. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hoàng Thị Thu Hà và PGS.

Phạm Ngọc Khái, những ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn và chia sẻ cho tôi những kiến thức, phƣơng pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý giá, luôn động viên, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi vô cùng biết ơn các nhà khoa học trong các hội đồng chấm thi và tham gia phản biện đã cho tôi những ý kiến quý giá để hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời dân xã Nguyên Xá đã nhiệt tình tham gia nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành đề tài luận án. Tôi luôn biết ơn các bạn bè, đồng nghiệp đã đóng góp công sức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.

Sau nữa, tôi vô cùng biết ơn những ngƣời thân trong gia đình đã luôn quan tâm, động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc để tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học và nghiên cứu để hoàn thành luận án. Tác giả luận án luan an ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình khoa học của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa có ai từng công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Khổng Thị Điệp luan an iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.

i LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC CÁC BẢNG. ix DANH MỤC CÁC HÌNH.

xii ĐẶT VẤN ĐỀ. 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở ngƣời.

Tình hình nhiễm E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng ở ngƣời. Tình hình kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL trên ngƣời.

Một số đặc điểm và phƣơng pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL. Đặc điểm sinh học. Đặc điểm và sự lƣu hành các ESBL và các gen mã hóa sinh ESBL.

Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài (phylogenetic group). Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn E. coli trên ngƣời. Khả năng lan truyền vi khuẩn E.

coli sinh ESBL. Các phƣơng pháp nghiên cứu E. coli sinh ESBL. 28 Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Đối tƣợng nghiên cứu.

Phƣơng pháp nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu. Phƣơng pháp chọn mẫu và tính cỡ mẫu. Các biến số và chỉ số nghiên cứu.

41 luan an iv 2. Vật liệu nghiên cứu. Các kỹ thuật áp dụng trong nghiên cứu. Kỹ thuật lấy mẫu phân.

Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập E. coli từ mẫu phân. Kỹ thuật định danh vi khuẩn E. Kỹ thuật xác định kiểu hình ESBL của các chủng E.

Kỹ thuật xác định đặc điểm kháng kháng sinh của E. coli sinh ESBL. Kỹ thuật xác định gen mã hóa sinh ESBL của E. coli sinh ESBL.

Kỹ thuật xác định gen mcr-1 kháng colistin của E. coli sinh ESBL. Kỹ thuật xác định đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL.

Kỹ thuật xác định gen độc lực của vi khuẩn E. coli sinh ESBL. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE. Kỹ thuật xác định các loại plasmid của các chủng E.

coli sinh ESBL. Xác định vị trí các gen mã hóa sinh ESBL bằng phƣơng pháp Southern Blot. Đánh giá khả năng truyền các gen mã hóa sinh ESBL của các chủng E. coli sinh ESBL trong mô hình phòng thí nghiệm bằng phƣơng pháp tiếp hợp66 2.

Phƣơng pháp xử lý số liệu. Biện pháp khống chế sai số. Đạo đức nghiên cứu. 69 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Sự lƣu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình. Đặc điểm của đối tƣợng xét nghiệm. Sự lƣu hành của của vi khuẩn E.

coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh. Đặc điểm sinh học của các chủng E. coli sinh ESBL. Đặc điểm sinh vật, hóa học của các chủng E.

coli sinh ESBL. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli sinh ESBL. Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E.

coli sinh ESBL. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E. coli sinh ESBL. Đặc điểm các gen độc lực trong các chủng E.

coli sinh ESBL. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli sinh ESBL. Phân tích đặc điểm plasmid của các chủng E.

coli sinh ESBL. 91 Chƣơng 4: BÀN LUẬN. Sự lƣu hành của vi khuẩn E. coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh tại cộng đồng nông thôn tỉnh Thái Bình.

Đặc điểm của đối tƣợng xét nghiệm. Sự lƣu hành của E. coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh. Đặc điểm sinh học của các chủng E.

coli sinh ESBL. Đặc điểm sinh vật, hóa học của các chủng E. coli sinh ESBL. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E.

coli sinh ESBL. Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E. coli sinh ESBL. Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E.

coli sinh ESBL. Đặc điểm các gen độc lực của các chủng E. coli sinh ESBL. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E.

coli sinh ESBL. Phân tích đặc điểm plasmid của các chủng E. coli sinh ESBL. Hạn chế và hƣớng nghiên cứu tiếp theo.

126 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN. 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC luan an vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Acid Deoxyribo nucleic AMP Ampicillin ATCC American Type Culture Collection ASTS Antibiotic Susceptibility Testing Surveillance (Chƣơng trình quốc gia giám sát độ nhạy cảm với kháng sinh) CAZ Ceftazidime CAZ-C Ceftazidime/acid clavulanic CFU Clon forming unit CHL Chloramphenicol CIP Ciprofloxacin CLA Acid clavulanic CLIG Cellobiose - lactose- indole - β- d-glucuronidase agar CLSI Clinical and Laboratories Standards Institute (Viện tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm) CTX Cefotaxim CTX-C Cefotaxim/acid clavulanic CXM Cefuroxim DAEC Diffusely adherent E. coli gây bám dính phân tán E. coli Escherichia coli EAEC Enteroaggregative E.

coli gây bám dính kết tập ruột) ECDC European Centre for Disease Prevention and Control luan an vii (Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh, Châu Âu) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EHEC Enterohemorrhagic E. coli gây xuất huyết đƣờng ruột) EIEC Enteroinvasive E. coli xâm nhập đƣờng ruột) EPEC Enteropathogenic E. coli gây bệnh đƣờng ruột) ETEC Enterotoxigenic E.

coli sinh độc tố ruột) ESBL Extended -Spectrum Beta-Lactamase FOF Fosfomycin FOX Cefoxitin GEN Gentamycin H2S Hydro Sulfua KAN Kanamycin LB Luria Betari LCR Ligase Chain Reaction LIM Lysine-Indole-Motility LT Heat-Labile-Toxin MEM Meropenem MIC Minimum Inhibitor Concentrate (nồng độ ức chế tối thiểu) MH Muller Hilton MLST Multi locus sequence typing (giải trình tự gen nhiều locus) NAL Nalidixic acid PCR Polymerase chain reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) luan an viii PCR-SSCP PCR single-strDNA conformational polymorphism PFGE Pulse-field gel electrophoresis (điện di xung trƣờng) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (đa hình chiều dài các đoạn cắt bởi enzyme giới hạn) SMART Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends program (Chƣơng trình giám sát xu hƣớng kháng kháng sinh) STR Streptomycin SXT Trimethoprim/sulfamethoxazole ST Shiga toxin STEC Shiga toxin-producing Escherichia coli TET Tetracyclin TE Tris-EDTA TSA Trypticase Soy Agar TSI Triple sugar/ iron agar WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) luan an ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. coli sinh ESBL ở một số bệnh viện (ASTS). Các kháng sinh để đánh giá kháng đa thuốc ở Enterobacteriaceae [85]. Ƣu, nhƣợc điểm của các phƣơng pháp phát hiện E.

coli sinh ESBL. Tên các kỹ thuật thực hiện trong nghiên cứu. Tiêu chuẩn chẩn đoán E. Đƣờng kính vùng ức chế đối với vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae của một số loại kháng sinh [43].

Trình tự mồi cho phản ứng PCR xác định các gen mã hóa sinh ESBL. Trình tự mồi cho phản ứng Realtime xác định gen mcr-1. Trình tự mồi cho phản ứng PCR đa mồi xác định nhóm phát sinh loài. Phân nhóm phát sinh loài dựa vào các gen chuA, yjaA, và TspE4C2.

Trình tự mồi cho phản ứng PCR xác định các gen độc lực. Trình tự các cặp mồi cho phản ứng PCR xác định các plasmid. Đặc điểm chung của đối tƣợng xét nghiệm. Đặc điểm của đối tƣợng xét nghiệm theo nhóm tuổi.

Đặc điểm hộ gia đình của các đối tƣợng xét nghiệm. Đặc điểm đối tƣợng xét nghiệm theo trình độ học vấn. Đặc điểm đối tƣợng xét nghiệm theo nghề nghiệp. Kết quả cấy mẫu phân ngƣời trên MacConkey có CTX 1µg/ml.

Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL trong mẫu phân ngƣời khỏe mạnh. Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL theo nhóm tuổi.

Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL theo giới tính. Số ngƣời mang E. coli sinh ESBL trong các hộ gia đình.

Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL theo các hộ gia đình. Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL theo trình độ học vấn.

Tỷ lệ mang E. coli sinh ESBL theo nghề nghiệp. Một số tính chất sinh vật, hóa học của E. coli sinh ESBL.

76 luan an x Bảng 3. Tỷ lệ kháng các loại kháng sinh của các chủng E. coli sinh ESBL. Mức độ kháng đa thuốc của các chủng E.

coli sinh ESBL. Tỷ lệ mang các kiểu gen mã hóa sinh ESBL nhóm CTX của các chủng E. coli sinh ESBL. Tỷ lệ mang các kiểu gen mã hóa sinh ESBL nhóm TEM, SHV của các chủng E.

coli sinh ESBL. Tỷ lệ xuất hiện các kiểu gen mã hóa sinh ESBL của E.