Ứng dụng di truyền phân tử và số lượng chọn giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ỨNG DỤNG DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ DI TRUYỀN SỐ LƯỢNG PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG CÁ TRA KHÁNG BỆNH GAN THẬN MỦ Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 9 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh – 12/2022 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ỨNG DỤNG DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ DI TRUYỀN SỐ LƯỢNG PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG CÁ TRA KHÁNG BỆNH GAN THẬN MỦ Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 9 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh – 12/2022 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan những công bố trong luận án “Ứng dụng di truyền phân tử và di truyền số lượng phục vụ chọn giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ” là trung thực và một phần kết quả trong nghiên cứu thuộc đề tài ‘Ứng dụng công nghệ sinh học chọn giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ’, thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản đến năm 2020 - Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn’ và đề tài “Cung cấp cá tra chọn giống cho người dân Đồng bằng sông Cửu Long”, thuộc chương trình VLIR-OUS, mã số đề tài SI-2019-01-26. Những số liệu trong luận án được phép công bố với sự đồng ý của các chủ nhiệm đề tài.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này chưa từng được tác giả khác công bố trong bất kì công trình nào khác. TÁC GIẢ LUẬN ÁN iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Sáng và TS. Nguyễn Hữu Thịnh, những người thầy hướng dẫn khoa học đã tận tình định hướng, hướng dẫn và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành nội dung các chuyên đề, bài báo và luận án.

Tôi luôn trân trọng và biết ơn sâu sắc về những hỗ trợ quý báu từ hai Thầy trong những năm học vừa qua. Xin được gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm cùng toàn thể các Thầy/Cô Giảng viên, Cán bộ và Viên chức của Khoa Thủy Sản và của phòng Sau đại học thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã có những góp ý về chuyên môn hữu ích cũng như tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và các thủ tục hành chính để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập, nghiên cứu và luận án. Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II cùng các phòng chức năng đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Chân thành cám ơn các cán bộ tại Trại Nghiên cứu Thực nghiệm Thủy sản Gò Vấp, Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh Nam Bộ, Trung tâm Quốc gia Giống Thủy sản Nước ngọt Nam Bộ và Trung tâm Công nghệ Sinh học (thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II) đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình thực nghiệm. Ngoài ra, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Phòng thí nghiệm Đa dạng Di truyền và Tiến hóa (Laboratory of Biodiversity and Evolutionary Genomics), Khoa Sinh học, Đại học KU Leuven (Vương quốc Bỉ) với những hỗ trợ về công nghệ và kĩ thuật để thực hiện thí nghiệm. Xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học cùng toàn thể các Thầy/Cô Giảng viên, Cán bộ, Viên chức trường Đại học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi về giảng dạy để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và luận án.

iv Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Hữu Phúc, ThS. Võ Hồng Phượng, TS. Nguyễn Thanh Vũ, ThS.

Trần Văn Nhiên, CN. Nguyễn Hoàng Thông, CN. Lê Hoàng Khôi Nguyên, CN. Nguyễn Thị Thảo Sương, CN.

Huỳnh Thị Trúc Quân và SV. Lưu Tăng Phúc Khang đã luôn sát cánh, động viên, chia sẻ mọi khó khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai bên gia đình đã luôn động viên để tôi có thể thực nghiệm và hoàn thành luận án đúng thời gian cho phép. Một lần nữa tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc với tất cả sự giúp đỡ quý báu trên.

HCM, ngày 15 tháng 12 năm 2022 Tác giả luận án v TÓM TẮT Nghiên cứu chọn giống cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) kháng bệnh gan thận mủ thế hệ G1 và các giải pháp kĩ thuật cho chọn lọc cá tra kháng bệnh thế hệ tiếp theo với các nội dung và kết quả đạt được là: • Ước tính các thông số di truyền tính trạng kháng bệnh gan thận mủ ở thế hệ G1 cá tra và đề xuất chọn lọc: Nghiên cứu đã sản xuất 155 gia đình full-sib và half-sib, ương đến kích cỡ cá giống còn lại 130 gia đình và đánh dấu từ PIT 7.664 con cá giống thuộc 130 gia đình cho thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh trong 2 bể, 16. Số lượng cá cho vào bể 1, bể 2 là 3.832/bể, mật độ cá là 1 cá/4,1 lít nước, nhiệt độ từ 26 - 28oC. Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Gly09M được sử dụng để gây cảm nhiễm cá thí nghiệm bằng phương pháp cohabitant kết hợp (tỉ lệ ghép cá cohabitant là 35% và liều bổ sung vi khuẩn là 105 CFU/mL). Ngoài ra, các cá thể thuộc 130 gia đình cá giống sau đánh dấu cũng được thả nuôi đánh giá tăng trưởng trong ao, trung bình 45 con/gia đình, tổng 5.838 cá thể được thả nuôi trong ao 2.

Sau 156 ngày nuôi, thu hoạch và thu thập số liệu về tỉ lệ sống, khối lượng, chiều dài. Ngoài ra, ở giai đoạn cá hương, 33 gia đình với 50 cá thể/gia đình được tiến hành cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm nhằm đánh giá khả năng kháng bệnh gan thận mủ và ước tính các thông số di truyền ở giai đoạn này. Nghiên cứu áp dụng mô hình tuyến tính hỗn hợp cá thể ước tính thông số di truyền trên tính trạng kháng bệnh giai đoạn cá hương, cá giống và tính trạng tăng trưởng, tỉ lệ sống lúc thu hoạch. Kết quả cho thấy, hệ số di truyền trên cá giống tại giai đoạn cắt ngang tỉ lệ sống toàn bộ 50%, 25% trong thí nghiệm cảm nhiễm bệnh gan thận mủ ở mức trung bình đến cao (0,22 - 0,38); đồng thời nếu chọn lọc tăng khả năng kháng bệnh ở giai đoạn cá giống không làm giảm khả năng kháng bệnh ở giai đoạn cá hương và tăng trưởng khi thu hoạch nhờ vào tương quan thuận giữa các tính trạng với nhau.

Nghiên cứu đã đề xuất được tính trạng sống chết tại cắt ngang tỉ lệ sống toàn bộ cá thí nghiệm 50% và 25% để xử lí số liệu nhằm ước tính giá trị chọn giống cho chọn lọc. vi • Nghiên cứu các giải pháp kĩ thuật hỗ trợ nâng cao hiệu quả của chọn giống cá tra kháng bệnh trong tương lai với các kết quả đạt được: - Nghiên cứu chỉ thi ̣phân tử microsatellite truy xuất phả hệ các gia đình cá tra phục vụ chọn giống: nghiên cứu sử dụng 10 microsatellite trong 01 bộ chỉ thị multiplex PCR. Nghiên cứu thực hiện sàng lọc các microsatellite đa hình, ổn định, phù hợp cho truy xuất phả hệ trên 50 mẫu cá tra bố mẹ G0, 50 mẫu cá con G1 và truy xuất phả hệ trên 50 gia đình bằng phương pháp xác định bố mẹ dựa trên khả năng. Các chỉ thi ̣microsatellite trong phân tích truy xuất phả hệ được tính tần số null-alen, tỉ lệ lỗi ghi nhận kiểu gen và tỉ lệ mismatch.

Kết quả cho thấy, 10 microsatellite đều ổn định, đa hình và phù hợp cho truy xuất phả hệ. Khi truy xuất phả hệ trên 50 gia đình sử dụng 10 microsatellite, Pahy-02 có tần số null-alen cao nên bị loại trừ ra khỏi truy xuất phả hệ. Bộ chỉ thị còn lại gồm 9 microsatellite có tỉ lệ truy xuất cả bố và mẹ đúng trong tất cả các gia đình cao (93,4%), đặc biệt trên gia đình con bố có half-sib (94,0%). Do đó, có thể ứng dụng 9 chỉ thị microsatellite vào truy xuất các gia đình cá tra chọn giống thay cho phương pháp đánh dấu vật lí như dấu PIT.

- Đánh giá và đề xuất chỉ tiêu miễn dịch tiềm năng là tính trạng kháng bệnh gan thận mủ phục vụ chọn giống: nghiên cứu lựa chọn hai nhóm gia đình cá giống kháng bệnh cao và thấp (3 gia đình/nhóm) thông qua giá tri ̣chọn giống ước tính (EBV) tại giai đoạn cắt ngang tỉ lệ cá sống toàn bộ cá thí nghiệm 50% trong thí nghiệm cảm nhiễm. Hai nhóm gia đình kháng bệnh cao và thấp này tiếp tục được gây cảm nhiễm nhằm đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch và xác định các chỉ tiêu miễn dịch giúp đánh giá được khả năng kháng bệnh của các cá thể phục vụ chọn giống. Tổng 119 cá thể KBC và KBT được thu mẫu máu và mẫu mô để đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch (tổng hồng cầu, tổng bạch cầu, bạch cầu đơn nhân, trung tính, lympho, trung tâm đại thực bào sắc tố ở gan, thận và lách và khả năng thực bào của đại thực bào, hiệu giá kháng thể) qua các thời điểm: ngay trước khi cảm nhiễm, 24, 48, 264 và 312 giờ sau cảm nhiễm. Kết quả cho thấy các chỉ tiêu miễn dịch đều có tiềm năng xác định các cá thể thuộc nhóm KBC hay KBT ở các thời điểm 24 - 48 hpi và 264 - 312 hpi, đặc biệt giai đoạn 24 - 48 hpi với các chỉ tiêu miễn dịch gồm bạch cầu trung tính, hiệu giá kháng thể, trung tâm đại thực bào ở gan.

vii SUMMARY Research on selective breeding of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) resistant to Bacillary Necrosis of Pangasius (BNP) in G1 and technical solutions to apply for the next generation of selection were carried out and achieved main results as following:  Genetic parameters’ estimation for resistance to BNP and suggestion for selection in the G1 generation: There were 155 full-sib and half-sib families produced. There were 130 families successfully nursed up till tagging size. Fish to be challenged (a total of 7,664 fish) were tagged by Passive Integrated Transponder (PIT) and then transferred to two replicate tanks, 16,000 litres each tank. The number of fish stocked in tank 1 and tank 2 was 3,832/tank, respectively and the density in challenge-test tanks was 1 fish/4.1 litres of water.

The water temperature was from 26 - 28oC. Bacterial strain Edwardsiella ictaluri Gly09M was used in the challenge-test experiment by combined cohabitant method with the ratio of cohabitant fish to the number of test fish 35% and bacteria addition to the test tanks at a density of 105 bacteria/mL water applied.