Luận án tiến sĩ: Phân lập và định danh vi khuẩn lactic ức chế Vibrio parahaemolyticus gây AHPND trên tôm biển

2/KHCN1-BM21 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus, GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (AHPND) TRÊN TÔM BIỂN Chủ nhiệm đề tài: ThS. NGUYỄN THỊ TRÚC LINH Chức danh: Giảng viên Đơn vị: Khoa Nông nghiệp - Thủy sản Trà Vinh, ngày tháng năm 2016 luan an TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus, GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (AHPND) TRÊN TÔM BIỂN Xác nhận của cơ quan chủ quản Chủ nhiệm đề tài (Ký, đóng dấu, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Trúc Linh Trà Vinh, ngày tháng năm 2016 2 luan an TÓM TẮT Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2014 đến tháng 8/2015 với mục đích tìm ra chủng vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mạnh nhất và ứng dụng chúng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp cũng như hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản vì thế đề tài "nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm biển" được tiến hành. Vi khuẩn lactic (LAB) được phân lập từ các nguồn khác nhau như: (1) ruột tôm biển; (2) ruột cá rô phi (Oreochromis niloticus); (3) bùn và nước của các ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh, và Sóc Trăng. Các dòng vi khuẩn LAB được sàng lọc bằng các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, và sinh hóa sau đó xác định tính đối kháng với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.

Thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn bằng bacteriocin và khả năng chịu đựng nồng độ muối của 5 chủng vi khuẩn kháng với Vibrio parahaemolyticus cũng được tiến hành. Kết quả phân lập từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi, bùn và nước ao tôm biển ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng là như sau: 30 chủng vi khuẩn lactic ở Trà Vinh, và 25 chủng vi khuẩn lactic ở Sóc Trăng đã được phân lập. Kết quả xác định khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus như sau: trong tất cả các chủng LAB phân lập được có 02 chủng có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus rất yếu với đường kính vô trùng nhỏ hơn 11 mm. Các chủng vi khuẩn này không thể ứng dụng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp.

40 chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhưng vòng vô trùng chỉ ở mức trung bình (++) từ 11-16mm. 13 chủng vi khuẩn còn lại có vòng vô khuẩn lớn (+++) từ lớn hơn 16 mm. Trong 13 chủng vừa nêu có 2 chủng rp5.1 có vòng vô khuẩn lớn nhất tương ứng là 18,2 và 18 mm. Nghiên cứu này cho thấy dòng rp5.1 có thể được sử dụng trong việc phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm biển.

Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của bacteriocin với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của 5 chủng vi khuẩn lactic là do vi khuẩn tiết acid lactic không phải tiết bacteriocin. Các chủng vi khuẩn thí nghiệm đều phát triển ở độ mặn từ 0-25‰ nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn 5-15‰, và phát triển chậm hơn ở độ mặn 25‰. Tuy nhiên ở chủng vi khuẩn lactic TV20 thì phát triển mạnh nhất ở độ mặn 25‰. 3 luan an MỤC LỤC TÓM TẮT.

3 DANH MỤC BẢNG BIỂU. 6 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH. 7 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT. 9 PHẦN MỞ ĐẦU.

10 1 Tính cấp thiết của đề tài. 10 2 Tổng quan nghiên cứu .1 Tổng quan về tình hình nuôi tôm nước lợ .1 Trên thế giới .2 Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi .1 Bệnh do virus trên động vật thủy sản .2 Bệnh do vi khuẩn trên tôm .3 Sơ lược về vi khuẩn lactic .4 Ứng dụng vi sinh vật hửu ích trong nuôi trồng thuỷ sản. 28 3 Mục tiêu nghiên cứu. 30 4 Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.2 Quy mô nghiên cứu .3 Phương pháp nghiên cứu .1 Dụng cụ và hóa chất .2 Phương pháp nghiên cứu .1 Thu mẫu và bảo quản mẫu .2 Tiến hành thí nghiệm .4 Phương pháp xử lý số liệu.

37 PHẦN NỘI DUNG. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn lactic từ các nguồn khác nhau và các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa .1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác nhau .2 Sàng lọc các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic. 39 Chương 2: Tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus trong điều kiện in vitro .1 Kết quả xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus trong điều kiện in vitro .2 Kết quả xác định khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahemolyticus của vi khuẩn lactic bằng bacteriocin .3 Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng lên mật số của vi khuẩn lactic. 43 Chương 3 Kết quả định danh dòng vi khuẩn phân lập được có khả năng kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .1 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s .2 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s .3 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s .4 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s.

48 PHẦN KẾT LUẬN. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 64 5 luan an DANH MỤC BẢNG BIỂU Tên bảng Số trang Bảng 2. Các loại virus chính gây bệnh trên tôm biển 14 Bảng 1 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic 40 6 luan an DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Tên biểu đồ Số trang Hình 2.

Dấu hiệu tôm bị bệnh hoại tử gan tuỵ 18 Hình 2. Hình dạng vi khuẩn V. Parahaemolyticus và thể thực 18 khuẩn Hình 2. Hình mô bệnh học của tôm khoẻ 19 Hình 2.

Hình mô bệnh học của tôm bệnh hoại tử gan tụy 19 Hình 2. Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 20 Hình 1: Quy trình phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, cá rô phi, 32 bùn đáy và nước ao nuôi tôm biển Hình 2: Quy trình xác định khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn 34 lactic với V. parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Hình 3 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V. 40 parahaemolyticus Hình 4 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V.

41 parahaemolyticus ở Trà Vinh Hình 5 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V. 41 parahaemolyticus ở Sóc Trăng Hình 6 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V. 41 parahaemolyticus tại Sóc Trăng Hình 7 Kết quả xác định khả năng ức chế vi khuẩn V. 42 parahaemolyticus bằng bacteriocin Hình 8 Kết quả thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng 43 lên mật số của vi khuẩn lactic 7 luan an DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU, ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG, TỪ NGẮN HOẶC THUẬT NGỮ AHPNS Acute Hepatapancreatic Necrosis Syndrome CFU Colony Forming Unit ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long DNA Deoxyribo Nucleic Acid EMS Early Mortality Syndrome FAO Food and Agriculture Organization GAV Gill Associated Virus HPV Hepatopancreatic Parvovirus IHHNV Hypothermal And Hematopoietic Necrosis Virus MBV Monodon Baculovirus MRS Man Rogosa Sharpe NA Nutrient Agar OIE Office International des Epizooties PCR Polymerase Chain Reaction PL Post Larval TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar TSA Tryptone Casein Soy Agar TSB Tripticase Soya Broth TSV Taura Syndrome Virus V.

P : Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus WSSV White Spot Syndrome Virus YHV Yellow Head Virus 8 luan an LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em đồng nghiệp, Ban Lãnh đạo Khoa Nông nghiêp Thủy sản, Phòng Khoa học Công nghệ và Ban Lãnh đạo Trường Đại học Trà Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và cấp kinh phí cho tôi thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS Trương Quốc Phú đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, quan tâm, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn đến PGS.

TS Đặng Thị Hoàng Oanh, Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận về cơ sở vật chất và dành rất nhiều thời gian để giúp tôi hoàn thành đề tài này. Xin chân thành cảm ơn các anh chị em tại Bộ môn Bệnh học Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ đã đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, những người thân, bạn bè và các em sinh viên lớp DA11TS đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu tại trường Đại học Trà Vinh. Xin chân thành cảm ơn! 9 luan an PHẦN MỞ ĐẦU 1.

Tính cấp thiết của đề tài Việc nuôi tôm sú, tôm thẻ ở Đồng Bằng sông Cửu Long trong những năm trước đây đã đem lại nguồn lợi nhuận đáng kể và góp phần vào việc phát triển nền kinh tế cho cả nước. Nhưng trong khoảng thời gian gần đây (2010 -2012), nghề nuôi tôm đang đối mặt với rất nhiều thách thức, dịch bệnh, môi trường ô nhiễm và hiện tượng tôm chết hàng loạt đã gây ra thiệt hại kinh tế hơn 800 tỷ đồng. Trong đó đáng quan tâm nhất là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome - AHPNS) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội chứng chết sớm (early mortality syndrome – EMS) (Lightner et al. Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009, ở Việt Nam vào năm 2010 rồi đến Thái Lan và Mã Lai vào năm 2011 (Lightner et al.

Bệnh này xuất hiện và gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở các Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre và Kiên Giang. Bệnh xuất hiện ở tôm sú và tôm thẻ khoảng 10 - 45 ngày sau khi thả giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% ở những ao nhiễm nặng. Tác nhân gây ra hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Lightner et al., 2012) mang thể thực khuẩn (Bateriophage) (Loc Tran, et al, 2012).