Luận án phát hiện đột biến gen ATP7B - Nghiên cứu gia đình bệnh nhân Wilson của Nguyễn Thị Mai Hương

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM pu VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Mai Hương PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG CÁC THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG CÁC THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội 2. Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học Lời cảm ơn Nghiên cứu được thực hiện dưới sự hỗ trợ, giúp đỡ của rất nhiều người. Tôi xin được trân trọng cảm ơn và luôn luôn ghi nhớ! Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi đến toàn bộ bệnh nhân Wilson và gia đình họ.

Nếu không có sự hợp tác nhiệt tình của họ, tôi đã không thể hoàn thành được nghiên cứu này. Tôi xin trân trọng cảm ơn hai người thầy: GS. Tạ Thành Văn, Trường Đại học Y Hà Nội và GS. Phan Văn Chi, Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong thời gian qua.

Tôi vô cùng biết ơn PGS. Trần Vân Khánh, Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý tận tình cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương và các anh, chị đồng nghiệp, đặc biệt là TS.BS Nguyễn Phạm Anh Hoa, Trưởng Khoa Gan-Mật đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu Tôi thực sự xúc động và tự hào bởi sự hỗ trợ nhiệt tình, sự động viên, chia sẻ của lãnh đạo và các đồng nghiệp tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, nơi tôi đang công tác, để tôi hoàn thành nhiệm vụ và nghiên cứu của tôi! Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô và các anh, chị tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi trong những chặng đường đã qua. Bố, mẹ đã mang tôi đến với cuộc sống, luôn dõi theo, cổ vũ và hỗ trợ! Tôi xin dành tặng kết quả nhỏ bé này tới bố mẹ tôi! Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự chia sẻ, giúp đỡ của các em tôi, của những người bạn dành cho tôi.

Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng. Chồng và các con của tôi là những người thân yêu nhất ở bên cạnh tôi, luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Đặc biệt, tôi muốn được chia sẻ niềm vui này với một thiên thần nhỏ trong gia đình tôi, con là lý do để tôi sống tốt hơn mỗi ngày. Vì con, tôi nguyện cố gắng để làm được những điều có ý nghĩa với gia đình, với cuộc sống và đặc biệt là với bệnh nhân của tôi. Nguyễn Thị Mai Hương i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả phối hợp với một số đồng nghiệp khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 29 tháng 06 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Mai Hương ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam. Dịch tễ học và phân loại bệnh Wilson. Dịch tễ học. Phân loại bệnh.

Cơ sở di truyền phân tử bệnh Wilson. Vị trí, cấu trúc phân tử gen ATP7B. Cấu trúc và chức năng protein ATP7B. Đặc điểm đột biến gen ATP7B.

Cơ chế bệnh sinh bệnh Wilson. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán, điều trị bệnh Wilson. Đặc điểm lâm sàng. Đặc điểm cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán và điều trị 23 bệnh Wilson.

Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến và chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson. Phát hiện người mang gen ATP7B bị đột biến. Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson. Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong chẩn đoán xác định bệnh Wilson.

Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger. Một số phương pháp khác được dùng trong phát hiện đột 29 biến gen ATP7B. Phương pháp phân tích đột biến mới. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Đối tượng nghiên cứu. Nhóm bệnh nhân và các thành viên trong gia đình. Nhóm chẩn đoán trước sinh. Tiêu chuẩn lựa chọn.

Tiêu chuẩn loại trừ. Hóa chất và thiết bị. Thiết bị và các loại tiêu hao.3 Phương pháp nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu.

Xây dựng phả hệ và thu thập mẫu. Phương pháp sử dụng trong phát hiện đột biến gen ATP7B 42 cho bệnh nhân Wilson và các thành viên trong gia đình. Phương pháp sử dụng trong chẩn đoán trước sinh cho thai nhi .4 Đạo đức nghiên cứu .5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Kết quả xác định đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân Wilson. Phát hiện đột biến gen ATP7B cho 78 bệnh nhân Wilson. Xác định đột biến gen ATP7B cho các thành viên gia đình 74 bệnh nhên Wilson. Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson.

Kết quả tách DNA tổng số từ dòng tế bào ối và PCR. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson. BÀN LUẬN KẾT QUẢ. Phát hiện đột biến gen ATP7B cho các thành viên trong gia đình 96 bệnh nhân Wilson.

Đặc điểm đột biến gen ATP7B của 78 bệnh nhân Wilson. Ý nghĩa của sàng lọc đột biến cho các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson. Ý nghĩa của chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson. 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

122 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI. 124 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH. 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO. Danh sách bệnh nhân, kết quả tách DNA tổng sổ và phân tích đột biến gen của 78 bệnh nhân và các thành viên trong 55 phả hệ.

Danh sách và kiểu gen của 78 bệnh nhân Wilson. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 21 exon của gen ATP7B. Trình tự đột biến gen của bệnh nhân có đột biến mới IVS20+4A>G. Bảng mã di truyền và viết tắt các acid amin.

Phả hệ và trình tự đột biến gen của các phả hệ được phát hiện sớm người mắc bệnh Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng. Kết quả sàng lọc đột biến đích cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân mã số WBW120501. Kết quả tách DNA của 3 mẫu dịch ối sau nuôi cấy. 32 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ Nghĩa tiếng việt ARMS Amplification refractory mutation Hệ thống đột biến chịu nhiệt system nhân bản ATOX1 Antioxidant protein 1 ATP Adenosine triphosphate ATP7A ATPase copper transporting alpha ATP vận chuyển đồng, chuỗi alpha ATP7B ATPase copper transporting beta ATP vận chuyển đồng, chuỗi beta bp base pair Cặp bazơ cDNA complementary DNA DNA bổ sung CTR1 Copper transporter Chất vận chuyển đồng cs Cộng sự Cu Đồng DNA Desoxyribonucleic acid ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxynucleotide triphosphate EtBr Ethidium bromide h hour giờ kb kilo base kDa kilo Dalton KF Kayser-Fleischer MDD Maximum dependence Phụ thuộc tối đa mô hình Decompositon Model phân hủy MLPA Multiplex Ligat on-dependent Kỹ thuật khuếch đại đa mồi Probe Amplification dựa vào phản ứng nối MM Markov Model Mô hình Markov vi MM/MM Missense mutation/ Missense Đột biến sai nghĩa/Đột biến mutation sai nghĩa mRNA messenger RNA RNA thông tin MRI Magnetic resonance imaging Chụp cộng hưởng từ RNA Ribonucleic acid NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RFLP Restricted fragment length Đa hình đột dài đoạn cắt giới polymorphism hạn SM/SM Servere mutation/Servere Đột biến nghiêm trọng/Đột mutation biến nghiêm trọn SM/MM Servere mutation/Missense Đột biến nghiêm trọng/Đột mutation biên sai nghĩa SNPs Single nucleotide polymorphisms Đa hình nucleotid đơn TGE Thr-Gly-Glu TGEA Thr-Gly-Glu-Ala TM Transmembrane Xuyên màng UTR Untranslated region Vùng không dịch mã WMM Weight Matrix Model Mô hình ma trận trọng lượng vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Bảng điểm Leipzig 2001 trong chẩn đoán bệnh Wilson .2 Các cặp mồi dùng trong PCR và giải trình tự gen ATP7B .3 Thành phần PCR .4 Thành phần phản ứng giải trình tự gen .1 Phân bố bệnh nhân theo giới và độ tuổi phát bệnh trung bình .2 Phân bố bệnh nhân theo địa phương .3 Kiểu gen của 78 bệnh nhân Wilson .4 Tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu .5 Các đa hình trên gen ATP7B được phát hiện trong nghiên cứu .6 Tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7B .7 Kết quả phân tích đột biến mới bằng chương trình tin sinh .8 Kiểu gen, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 7 bệnh nhân Wilson có đột biến mới .9 Kết quả phân tích đột biến vùng cắt, nối của gen ATP7B.10 Kết quả sàng lọc đột biến gen ATP7B cho các thành viên của 55 phả hệ.11 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở bố, mẹ của bệnh nhân Wilson .12 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson .13 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 13 trường hợp bị Wilson được phát hiện qua sàng lọc gia đình.14 Đặc điểm cận lâm sàng, kiểu gen và điểm chẩn đoán của 5 trường hợp mắc Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng .15 Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm họ hàng của bệnh nhân.16 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson.1 Đột biến thường gặp trên gen ATP7B trong nghiên cứu và một số nước châu Á.

103 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. Gen ATP7B và protein ATP7B-ATPase tương ứng ở người .2 Quá trình chuyển hóa đồng trong gan .1 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160802 .2 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW100604 .3 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160609 .4 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW170704 .5 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160507 .6 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW160507 .7 Trình tự gen của bệnh nhân mã số WBW140801 .8 Biểu đồ tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7 .9 Vị trí và tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu .10 Sơ đồ các bước phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhi mắc bệnh Wilson .11 Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình SIFT .