Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật đất nhiễm dioxin Biên Hòa và khả năng phân hủy bởi Phạm Quang Huy

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM QUANG HUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ CHỦNG PHÂN LẬP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2021 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM QUANG HUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ CHỦNG PHÂN LẬP Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ sinh học TS. Nguyễn Kim Thoa Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2021 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. Đặng Thị Cẩm Hà và TS.

Nguyễn Kim Thoa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất cũng như động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất để tôi có thể thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài độc lập cấp nhà nước: “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gen, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” do PGS.

Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện. Cuối cùng, tôi xin gửi tới người thân trong gia đình cùng bạn bè sự biết ơn, đặc biệt là bố mẹ đã dành cho tôi tình yêu thương sâu sắc và tạo điều kiện tốt nhất để tôi học tập và hoàn thành tốt nội dung luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021 NCS. Phạm Quang Huy i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Các thông tin trích dẫn trong luận án đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021 Tác giả NCS. Phạm Quang Huy ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.i LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC.iii DANH MỤC CÁC BẢNG. vi DANH MỤC CÁC HÌNH.

vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT. ix MỞ ĐẦU. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin.

Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và con người. Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm. Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.

Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm. Đa dạng vi khuẩn kị khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm dioxin. Đa dạng gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy chất diệt cỏ/dioxin. Sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô nhiễm POPs.

19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Các hóa chất và thiết bị máy móc. Môi trường nuôi cấy.

Phương pháp nghiên cứu. Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome. Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu. Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.

Phương pháp xác định hoạt tính laccase và laccase-like. Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn hợp VSV. Phương pháp tách chiết DNA metagenome. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA metagenome.

Phân tích trình tự DNA metagenome của C và BHR.36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn quy mô phòng thí nghiệm. Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng. Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng.

Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C và BHR. Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C và BHR. Trình tự, contig và gene chức năng từ metagenome của mẫu C và BHR. Đa dạng VSV của metagenome C và BHR.

Mối liên hệ giữa một số chi vi khuẩn với tổng độ độc và các đặc tính lý hóa của đất. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của metagenome C và BHR. Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin. Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome đã được phát hiện.

76 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C và BHR thu được. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của metagenome C và BHR (một trong 4 con đường phân hủy và khoáng hóa dioxin).92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 95 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI.

97 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH. 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 105 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn.

Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi chủng XKBHA22. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn. Trình tự read chất lượng cao. Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR.

Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR. Đa dạng ở các mức độ phân loại của metagenome C và BHR 52 Bảng 3. Một số chi có các đại diện đã được chứng minh có khả năng phân huỷ chất diệt cỏ/ dioxin. Đa dạng nấm sợi và nấm đảm trong metegenome của C và BHR.

Số lượng trình tự tương đồng cao với các gene chức năng trong tập dữ liệu chuẩn hóa. Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới con đường phân 2,4- D và polychlorinated biphenyl (PCB) dựa trên cơ sở dữ liệu KEEG. 72 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB.

Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T.3: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương pháp sinh học. Nghiên cứu theo hướng -Omics trong sinh học. Các bước thực hiện phân tích metagenomic. Mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C).

Mặt cắt dọc của lô xử lý. Mẫu đất trong lô xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học (ký hiệu BHR). Sơ đồ thực hiện nghiên cứu. Quy trình phân tích dữ liệu DNA metagenome trên hệ thống MG RAST.

Hình thái khuẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, BHBi5, BHBi7 và BHO9 từ mẫu làm giàu trên môi trường MSM chứa dịch chiết đất. Hình thái tế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét 41 Hình 3. Cây phát sinh chủng loại của 5 chủng vi khuẩn. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp vi khuẩn A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng vi khuẩn.

Hình thái khuẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn và sinh trưởng của chúng trên môi trường Gause M chứa DCĐ. Cây phát sinh chủng loài của chủng xạ khuẩn XKBH921. Khả năng sinh tổng hợp laccase- like của 5 chủng xạ khuẩn. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp xạ khuẩn.

Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose. Đa dạng ở các mức độ khác nhau của metagenome C (vòng ngoài) và BHR (vòng trong) trên cơ sở dữ liệu RefSeq. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ ngành trong metagenome C và BHR. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR 53 Hình 3.

Đa dạng vi khuẩn ở mức độ bộ trong metagenome C và BHR 54 Hình 3. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ họ trong metagenome C và BHR 55 Hình 3. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ chi trong metagenome C và BHR 56 Hình 3. Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành trong metagenome C và BHR.

Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ chi trong metagenome C và BHR. Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome C và BHR. Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR 65 Hình 3.

Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu thế ít chênh lệch trong metagenome của mẫu C và BHR. Tương quan gene liên quan đến chuyển hóa xenobiotic giữa metagenome C và BHR.