Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) chuyển gen kháng PRSV

Header Page 1 of 132. a VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THANH NGA NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƯA HẤU (CITRULUS LANATUS THUMB.) CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 Footer Page 1 of 132. Header Page 2 of 132. b VIỆN VIỆN HÀN HÀN LÂM LÂM KHOA KHOA HỌC HỌC VÀ VÀ CÔNG CÔNG NGHỆ NGHỆ VIỆT VIỆT NAM NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Nguyễn Thị Thị Thanh Thanh Nga Nga NGHIÊN NGHIÊN CỨU CỨU TẠO TẠO DÒNG DÒNG CÂY CÂY DƢA DƢA HẤU HẤU (CITRULUS LANATUS THUMB.) (CITRULUS LANATUS THUMB.) CHUYỂN CHUYỂN GEN GEN KHÁNG KHÁNG BỆNH BỆNH VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV Chuyên Chuyênngành: ngành:DiDitruyền truyềnhọc học Mã Mãsố: số:6262424201012121 LUẬN LUẬN ÁN ÁN TIẾN TIẾN SỸ SỸ SINH SINH HỌC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.

LÊ TRẦN BÌNH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. LÊ TRẦN BÌNH Viện Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học HÀ NỘI, 2015 HÀ NỘI, 2015 Footer Page 2 of 132. Header Page 3 of 132. i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, GS.

Lê Trần Bình đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Tường Vân, TS.

Phạm Bích Ngọc, Ths. Phạm Thị Vân cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện làm việc, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án. Tôi xin cảm ơn Trại Sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế, Viện Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ tôi trong việc trồng cây thu hạt giống trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông – Lâm cùng các đồng nghiệp đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Nga Footer Page 3 of 132. Header Page 4 of 132.

ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Nga Footer Page 4 of 132. Header Page 5 of 132. iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………. Giới thiệu về cây dưa hấu và bệnh hại dưa hấu…………………………. Các loại bệnh hại dưa hấu………………………………………. Bệnh virus hại dưa hấu………………………………………….

PRSV và PRSV gây hại trên dưa hấu……………………. Phạm vi kí chủ, cơ chế truyền bệnh ……………………………………. Biện pháp phòng trừ …………………………………………………… 20 1. PRSV gây bệnh trên dưa hấu…………………………………………… 20 1.

Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus…. Kỹ thuật RNAi…………………………………………………………. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus……………. Một số hạn chế của công nghệ RNAi và giải pháp…………………….

Một số nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho dưa hấu ……. 29 Footer Page 5 of 132. Header Page 6 of 132. iv Chƣơng 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu……………………………………………. Vật liệu thực vật………………………………………………………… 31 2. Chủng vi sinh vật, vector……………………………………………….

Dụng cụ, thiết bị, vật tư………………………………………………… 32 2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu………………………. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ……………………………………….

Chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu…………………… 44 2. Phân tích cây chuyển gen kháng PRSV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………… 49 3. Xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu ………………………………… 49 3.

Khả năng tái sinh chồi và cụm chồi …………………………………… 49 3. Kết quả kích thích kéo dài chồi………………………………………… 54 3. Kết quả tạo rễ cho chồi ………………………………………………… 55 3. Ảnh hưởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây in vitro… 56 3.

Tổng kết quy trình tái sinh ……………………………………………. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ………………………………. Đánh giá khả năng sống sót của cây dưa hấu trên môi trường chứa chất Footer Page 6 of 132. Header Page 7 of 132.

v chọn lọc Km. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu ………………………………… 63 3.

Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen gus ………………………. Kết quả chuyển gen gus vào cây dưa hấu. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi vào dưa hấu. Kết quả phân tích biểu hiện gen và đánh giá khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen.

Phân tích các dòng cây chuyển gen T0. Phân tích các dòng cây chuyển gen T1. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…. Khả năng nuôi cấy in vitro cây dưa hấu……………………………….

Khả năng chuyển gen ở dưa hấu……………………………………. Tạo tính kháng virus bằng chuyển gen ở dưa hấu………………………. Triển vọng của các dòng chuyển gen trong bối cảnh GMO chung. 94 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.

98 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO Footer Page 7 of 132. Header Page 8 of 132. vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit Ribonucleic BAP 6 - Benzyl Amino Purin IAA Indol - 3 - Axetic Axit IBA 3 - Indol Butyric Axit NAA α - Naptalen Axetic Axit bp Base pair CP Coat protein Nib Nuclear Inclusion Body protein HC-Pro Helper component-proteinase dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine Tetra-acetic Acid LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction RNAi RNA interference miRNA microRNA siRNA small interfering RNA mRNA messenger RNA dsRNA double-stranded RNA RISC RNA-induced silencing complex Taq Thermus aquaticus Footer Page 8 of 132. Header Page 9 of 132.

vii PRSV Papaya ringspot virus Km kanamycin Cefo Cefotaxime X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide gus beta-glucuronidase Footer Page 9 of 132. Header Page 10 of 132. viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần dinh dưỡng trong dưa hấu…………………………… 9 Bảng 1.

Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dưa hấu …………. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA và BAP… 36 Bảng 2. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA, BAP, NAA…………………………………………………………………………… 36 Bảng 2. Nồng độ GA3 sử dụng trên MT kéo dài chồi…………………….

Nồng độ IBA sử dụng trên MT tạo rễ ……………………………. Thành phần các loại giá thể thích ứng cây in vitro ………………. Các nồng độ Km sử dụng. Thành phần các loại môi trường.

Ảnh hưởng của tuổi lá mầm tái sinh chồi…………………………. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, BAP, NAA đến sự phát sinh chồi…. Ảnh hưởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có kích thước < 1cm……………………………………………………. Ảnh hưởng của IBA và môi trường cơ bản đến khả năng tạo rễ của chồi dưa hấu……………………………………………………………….

Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích ứng cây ra môi trường. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến sự phát triển của chồi. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu……………………………. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu.

Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu. 69 Footer Page 10 of 132. Header Page 11 of 132. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu.

Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp- Nib-HCpro thế hệ T0 và WT. Kết quả PCR phân tích các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T1. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp- Nib-HCpro thế hệ T1 và cây WT. 82 Footer Page 11 of 132.

Header Page 12 of 132. x DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc của PRSV…………………………………………………. Bản đồ tổ chức genome của PRSV………………………………….

Con đường tạo thành RNAi………………………………………. Sơ đồ vector pCB-gusplus…………………………………………. Sơ đồ vector pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro ……. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát………………………………………….

Ảnh hưởng của tuổi lá mầm dưa hấu đến khả năng tái sinh chồi…. Ảnh hưởng của vị trí trên lá mầm đến khả năng tái sinh chồi……… 50 Hình 3. Kết quả tái sinh chồi dưa hấu từ lá mầm sau 6 tuần nuôi cấy……… 52 Hình 3. Hình ảnh chồi có hình thái bất thường so với đối chứng…………… 52 Hình 3.

Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi. Kết quả tạo rễ cho chồi dưa hấu D2………………………………… 56 Hình 3. Kết quả thích ứng cây in vitro……………………………………… 57 Hình 3. Một số hình ảnh về xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu……… 59 Hình 3.

Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến biểu hiện gus. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến biểu hiện Gus. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện gus………. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn đến biểu hiện Gus………………………………………………………………….

Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dưa hấu. Biểu hiện bền vững của gus ở các dòng dưa hấu chuyển gen. 66 Footer Page 12 of 132. Header Page 13 of 132.

Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen nptII trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen T0 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%. Một số hình ảnh chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro……….

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%. Mẫu lá bí ngô bị nhiễm PRSV……………………………………. Các mức độ biểu hiện bệnh ở lá dưa hấu chuyển gen. Một số hình ảnh về tính kháng bệnh PRSV của các dòng dưa hấu chuyển gen.

Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen D2.7 thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen L2.3 thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri. 80 Footer Page 13 of 132. Header Page 14 of 132.