Nghiên cứu tạo hạt giả virus lở mồm long móng type O trong hệ biểu hiện baculovirus tế bào côn trùng - Nguyễn Phương Hoa

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN PHƯƠNG HOA NGHIÊN CỨU TẠO HẠT GIẢ VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG HỆ BIỂU HIỆN BACULOVIRUS TẾ BÀO CÔN TRÙNG ĐỊNH HƯỚNG SẢN XUẤT VACCINE LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2020 1 luan an VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GUYỄN P NGHIÊN CỨU TẠO HẠT VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG HỆ BIỂU HIỆN BACULOVIRUS TẾ BÀO CÔN TRÙNG ĐỊNH HƯỚNG SẢN XUẤT VACCINE Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Thị Kim Cúc Viện Hóa sinh biển 2. Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học Hà nội, 2020 2 luan an LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sau sắc tới hai thầy hướng dẫn cho tôi hoàn thành luận án, PGS. Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Hóa sinh biển và PGS.

Đinh Duy Kháng, Viện Công nghệ sinh học. Kết quả đạt được ngày hôm nay có sự tận tâm dạy dỗ, định hướng cho tôi trong nghiên cứu, truyền cho tôi niềm say mê và kiến thức khoa học vững chắc. Một lần nữa xin được cảm ơn Thầy cô của tôi. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Chủ nhiệm đề tài TS.

Lê Thị Hồng Minh đã cho phép và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện luận án theo hướng nghiên cứu của đề. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã cử tôi đi học, PGS. Phạm việt Cường, TS. Nguyễn Hoàng Dương, cùng tập thể đồng nghiệp Trung tâm sinh học phân tử Nghĩa Đô, nơi tôi làm việc đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cơ sở đào tạo, Viện Công nghệ sinh học và Ths. Bùi Thị Hải Hà cán bộ phụ trách NCS đã hướng dẫn và gúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập này. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, gia đình đã luôn bên tôi, cổ vũ và động viên tôi, hoàn thành tốt luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nôi, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS.

Nguyễn Phương Hoa i luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả có được cùng sự cộng tác với các cộng sự khác. Tất cả số liệu và kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên nghành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại trong luận án chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác Hà nôi, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS. Nguyễn Phương Hoa ii luan an MỤC LỤC Lời cảm ơn.

i Lời cam đoan. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT. iv DANH MỤC CÁC BẢNG.

v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ. vi MỞ ĐẦU. 3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Bệnh lở mồm long móng. Giới thiệu chung về bệnh lở mồm long móng. Tình hình dịch bệnh LMLM trên thế giới. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam.

Virus gây bệnh LMLM. Cấu trúc của virus LMLM. Các type huyết thanh của Virus LMLM. Chẩn đoán bệnh LMLM.

Đặc tính của virus LMLM ở mức độ phân type. Vaccine phòng bệnh LMLM. Hạt giả virus (VLP) và vaccine phát triển bằng công nghệ VLP. Khái niệm về VLP.

Phương pháp tạo hạt giả virus VLP. Các hệ thống biểu hiện tạo VLP. Các loại vaccine VLP. Hệ biểu hiện VLP cho virus LMLM.

38 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. 44 iii luan an 2. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp RT-PCR tạo cDNA. Thiết kế các primer để nhân dòng các gen VP0, VP1-2A và VP3. Tách dòng các gen VP0, VP1-2A và VP3, giải trình tự. Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 và VP1-2A-VP3.

Tạo bacmid tái tổ hợp trong tế bào E. coli DH10Bac. Biểu hiện các cụm gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng. Tối ưu biểu hiện hai cụm gẹn VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng tạo VLP-LMLM lớn nhất.

Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid. Phương pháp Western Blot. Phương pháp thu hổi VLP. Phương pháp soi kính hiển vi điện tử truyền qua.

Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên chuột. Đánh giá gây đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên bê. Kiểm tra độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm.

Đánh giá hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM. 67 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1 Phân lập các gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3. Thiết kế các primer cho 3 gen VP0, VP1-2A và VP3. Tổng hợp cDNA.

Lựa chọn chủng làm nghuyên liệu nghiên cứu. Tách dòng và giải trình tự các gen VP0, VP1-2A và VP3. Tối ưu các gen VP0, VP1-2A và P3 tạo thành hai cụm gen VP0, VP1- 2A-VP3. Thiết kế vector pFastBacTM Dual mang gen VP0 và VP1-2A-VP3.

Kết quả tạo vector pFastBacTM Dual mang cụm gen VP1-2A-VP3. Tạo vector pFastBacTM DualVP1-2A-VP3 mang gen VP0. Tạo bacmid tái tổ hợp mang gen VP1-2A-VP3 và VP0 trong tế bào E. coli DH10Bac.

82 iv luan an 3. Biểu hiện gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng tạo VLP. Nuôi cấy tăng sinh lượng lớn tế bào côn trùng. Nhiễm bacmid tái tổ hợp vào tế bào côn trùng tạo Bac stock P1.

Biểu hiện Bac stock P2 trong tế bào côn trùng. Kiểm tra sự tạo thành VLP bằng kính hiển vi điện tử TEM. Tối ưu biểu hiện Bac stock P2 trong tế bào côn trùng. Xác định dòng tế bào thích hợp nhiễm biểu hiện tạo VLP-LMLM lớn nhất.

Xác định nồng độ tế bào côn trùng và khoảng thời gian thích hợp để lượng VLP-LMLM thu được lớn nhất. Kiểm tra protein trên gel polyacrylamid và Western blot. Đánh giá khả năng gây miên dịch của VP-LMLM trên động vật. Kết quả gây miễn dịch của VLP-LMLM trên chuột lang.

Kết quả kiểm tra độc tính của VLP-LMLM trên chuột thí nghiệm. Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của VLP-LMLM trên bê. Nghiên cứu thử nghiệm liều sinh miễn dịch trên bê. Đánh giá hiệu giá kháng thể của VLP-LMLM.

102 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ. Phân lập các gen cấu trúc VP0, VP1-2A và VP3. Tối ưu codon trong hai cụm genVP0 và VP1-2A-VP3. Biểu hiện hai gen VP0, VP1-2A-VP3 trong tế bào côn trùng.

Thử nghiệm VLP-LMLM trên động vật thí nghiệm. 113 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 116 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ. 117 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.

119 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 128 v luan an DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích ATP Adenosine triphosphat APS Amonium persulphate Amp Ampicillin ARN Ribonucleic acid BSA Bovine serum albumin cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid CBB Comassie brillant blu R-250 EtBr Ethidium bromite ELISA Enzyme linked immunosorbent assay FMD Foot Mouth Disease FBS Phosphat buffered saline GDP Gross Domestic Product ELISA Enzyme linked immunosorbent assay IRES Internal Ribosome Entry Site Kb Kilo base IPTG Isopropylthio-β-D-galactosita LB Lauria Betani BLAST Basic Local Alignment Search Tool LMLM Lở mồm long móng mRNA Messenger Ribonuclease Acid TTH Tái tổ hợp vi luan an NEB Native Elution Buffer NWB Native Wash Buffer NPB Native purification Buffer OIE Organization of International Epizootics ORF Open reading frame OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PBS Phosphat buffered saline PVDF Polyvinylidene difluoride RNA Ribonucleic acid RT Revesec transcriptase SDS Sodium dodecyl sulphat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphat- polyacrylamide gel electrophoresis TBS Tris buffered saline TEDED N, N, N’, N’- tetramethyl ethylenediamine TTBS Tween- Tris Buffered Saline UTR Untranslated region VLP Virus-like particles vii luan an DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tóm tắt các đợt bùng phát dịch LMLM 2007 đến 2017.1: Danh sách mẫu bệnh phẩm virus LMLM sử dụng trong nghiên cứu .2: Thành phần phản ứng PCR từ cDNA .3: Thông tin cặp mồi FMDV-1F/1R được sử dụng.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại sản phẩm PCR .5: Phản ứng gắn gen VP1-2A-VP3 vào vector pFastBacTM Dual .6: Trình tự cặp mồi M13 .7: Chu trình nhiệt phản ứng PCR gen VP0 vàVP1-2A-VP3 .8: Thành phần gel polyacrylamide12% .9: Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch của VPL-LMLM trên huột.1: Kết quả tách chiết AR từ các mẫu LMLM .2: Các cặp primer khuếch đại các gen VP0, VP3 và VP1-2A .3: Trạng thái của tế bào sau khi lây nhiễm .4: Kết quả xác định liều tiêm phù hợp kháng nguyênVLP-LMLM .5: Tổng kết sự thay đổi kháng thể (tính theo chỉ số PI) của chuột thử nghiệm ở nồng độ 400 ng/liều .6: Bảng theo dõi chuột trong 10 ngày sau tiêm VLP-LML .7: Kết quả kiểm tra huyết thanh bê trước khi thử nghiệm .8: Tổng hợp kết quả xác định liều sinh miễn dịch .9: Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể từ HT bê. 102 viii luan an DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bản đồ tình trạng bệnh LMLM khu vực Đôg Nam Á .2: Tổ chức hệ gen của virus LMLM và cấu trúc của virus .3: Vòng đời của virus lở mồm long móng tròng tế bào chủ .4: Cấu trúc VLP các loại virus sử dụng làm vaccine .5: Cấu trúc virus tự nhiên và hạt giả virus (VLP-virus-like particle) .6: Cấu trúc của Baculovirus Mulicapsid nucleopolyhedrovirus .7: Mô tả quá trình biểu hiện trong hệ thống Bạc-to-Bac® baculovirus .1: Sơ đồ vector pFastBacTM Dual mang hai cụm gen VP0, VP1-2A-P3 .1: Kết quả PCR sử dụng cặp mồi định tính LMLM FMD-1F/R .2: Ảnh tách dòng gen gel agarose 1% các gen VP3, VP1-2A, VP0 .3: Ảnh tách dòng gen gel agarose 1% các gen VP3, VP1-2A, VP0 .7: Ảnh kiểm tra DNA trên gel agarose 1%.8: Đĩa biến nạp vector pFastBacTM Dual mang gen VP1-2A-VP3 .10: Khuẩn lạc mang vector p DualVP1-2A-VP3; pUC57-VP0 .12: Đĩa biến nạp pDual-VP1-2A-VP3 gắn gen VP0 và điện di trên gel agarose1%.coli DH10Bac biến nạp vector pDual VP1-2A-VP3-VP0 .15: Hình thái tế bào Sf9 ở các độ phóng đại khác nhau .16: Hình thái tế bào SF9 ở các giai đoạn khác nhau .17: Hình thái tế bào sau khi nhiễm Bac stock P1 .18: Ảnh kiểm tra biểu hiện protein sau 24 h, 48 h, 72 h, 96 h nuôi cấy. 94 ix luan an Hình 3.

Ảnh chụp TEM đánh giá sự hình thành VLP-LMLM .20: Hình thái tế bào sau khi nhiễm vào hai loại tế bào Sf9 và Sf21 .21: Hình thái tế bào sau các khoảng thời gian lây nhiễm khác nhau tại các mật độ khác nhau .22: Ảnh điện di kiểm tra biểu hiện protein .