Luận án tiến sĩ: Phương pháp phân tích vi rút cao cấp trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Phan Thị Thanh Hà
Nghiên cứu phương pháp phân tích nhanh vi rút nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm di truyền của chúng.
Công nghệ Sinh học
Luan An
Luận án Tiến sĩ
Năm xuất bản
Số trang
199
Thời gian đọc
30 phút
Lượt xem
0
Lượt tải
0
Phí lưu trữ
50 Point
Tóm tắt nội dung
I. Tổng quan vi rút nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Nhuyễn thể hai mảnh vỏ lọc nước để kiếm ăn. Cơ chế này tích tụ vi rút gây bệnh. Hàu, ngao, sò và trai đều mang nguy cơ. Người tiêu dùng thường ăn các loài này ở dạng sống hoặc tái. Nguy cơ lây nhiễm vì thế tăng cao. Bốn nhóm vi rút đáng lo ngại nhất gồm Norovirus, vi rút viêm gan A, vi rút viêm gan E và Astrovirus ở người. Chúng truyền qua thực phẩm và gây bệnh đường tiêu hóa. Nhiều vụ ngộ độc thực phẩm bắt nguồn từ nhuyễn thể nhiễm vi rút. Việt Nam là quốc gia sản xuất và tiêu thụ thủy sản lớn. An toàn thực phẩm trở thành yêu cầu cấp thiết. Nghiên cứu này xây dựng phương pháp phân tích nhanh và chính xác. Mục tiêu là phát hiện và định lượng vi rút nguy cơ cao. Phạm vi tập trung vào RNA vi rút trong mô nhuyễn thể.
1.1. Đặc điểm sinh học vi rút truyền qua thực phẩm
Các vi rút mục tiêu đều mang vật liệu di truyền RNA. Kích thước hạt vi rút rất nhỏ. Chúng bền vững trong môi trường nước biển. Quá trình nấu nướng thông thường khó tiêu diệt hoàn toàn. Vi rút không nhân lên trong nhuyễn thể. Nhuyễn thể chỉ đóng vai trò vật mang. Liều gây nhiễm rất thấp. Vài hạt vi rút đủ để gây bệnh. Đặc điểm này khiến việc phát hiện trở nên khó khăn. Phương pháp phân tích cần độ nhạy rất cao.
1.2. Tình hình nhiễm vi rút tại Việt Nam và thế giới
Norovirus là nguyên nhân hàng đầu gây viêm dạ dày ruột. Vi rút viêm gan A và E gây tổn thương gan. Astrovirus ảnh hưởng nhiều đến trẻ nhỏ. Nhiều quốc gia ghi nhận các vụ bùng phát liên quan đến hàu. Dữ liệu giám sát tại Việt Nam còn hạn chế. Sự lưu hành các kiểu gen chưa được khảo sát đầy đủ. Nghiên cứu này bổ sung dữ liệu dịch tễ phân tử quan trọng. Kết quả hỗ trợ công tác cảnh báo sớm.
1.3. Tiêu chuẩn ISO 15216 trong kiểm nghiệm vi rút
ISO 15216-1:2013 là tiêu chuẩn quốc tế tham chiếu. Tiêu chuẩn quy định quy trình phát hiện Norovirus và vi rút viêm gan A. Phương pháp dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR. Chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn khá dài. Nghiên cứu này mở rộng tiêu chuẩn cho HEV và HAstV. Việc tuân thủ ISO bảo đảm độ tin cậy kết quả. Phòng thí nghiệm dễ dàng so sánh dữ liệu.
II. Phương pháp tách chiết RNA vi rút từ nhuyễn thể hai mảnh
Tách chiết RNA là bước nền tảng của quy trình phân tích. Chất lượng RNA quyết định độ chính xác kết quả. Mô tiêu hóa của nhuyễn thể chứa nồng độ vi rút cao nhất. Quá trình tách chiết bắt đầu từ việc giải phóng vi rút khỏi mô. Enzyme proteinase K hỗ trợ phân giải protein. Vi rút được tách ra khỏi nền mẫu phức tạp. Nhuyễn thể chứa nhiều chất ức chế phản ứng. Polysaccharide và glycogen gây nhiễu cho enzyme. Bước tinh sạch loại bỏ các chất này. Hạt từ tính hoặc cột silica giữ lại RNA. Các chất ức chế bị rửa trôi. RNA tinh sạch được thu hồi với độ tinh khiết cao. Đối chứng quy trình được bổ sung vào mỗi mẫu. Vi rút Mengo thường dùng làm đối chứng kiểm soát. Hiệu suất tách chiết được tính toán dựa trên đối chứng này. Quy trình chuẩn hóa giúp kết quả ổn định giữa các lần phân tích.
2.1. Xử lý mẫu mô tiêu hóa nhuyễn thể
Mô tuyến tiêu hóa được tách riêng khỏi cơ thể. Khối lượng mẫu được cân chính xác. Mẫu được nghiền đồng nhất. Dung dịch đệm hỗ trợ phân tán mô. Enzyme tiêu hóa được thêm vào hỗn hợp. Quá trình ủ diễn ra ở nhiệt độ kiểm soát. Vi rút thoát ra khỏi mô liên kết. Dịch nổi chứa vi rút được thu lại. Bước này quyết định lượng vi rút thu hồi.
2.2. Tinh sạch và loại bỏ chất ức chế phản ứng
Nhuyễn thể giàu chất ức chế Real-time RT-PCR. Chất ức chế làm sai lệch tín hiệu khuếch đại. Cột silica hoặc hạt từ liên kết chọn lọc với RNA. Dung dịch rửa loại bỏ tạp chất. Ethanol hỗ trợ quá trình gắn kết. RNA được giải phóng bằng dung dịch rửa giải. Sản phẩm cuối có độ tinh khiết cao. Tỷ lệ hấp thụ quang xác nhận chất lượng RNA.
2.3. Kiểm soát chất lượng RNA bằng đối chứng nội
Đối chứng quy trình theo dõi toàn bộ các bước. Vi rút Mengo được bổ sung trước khi tách chiết. Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức chuẩn. Giá trị thấp báo hiệu lỗi trong quy trình. Đối chứng khuếch đại phát hiện chất ức chế còn sót. Mẫu đạt yêu cầu khi đối chứng cho tín hiệu hợp lệ. Kiểm soát chất lượng bảo đảm kết quả đáng tin cậy.
III. Kỹ thuật Real time RT PCR phát hiện vi rút trong nhuyễn thể
Real-time RT-PCR là kỹ thuật cốt lõi của nghiên cứu. Phương pháp phát hiện và định lượng RNA vi rút cùng lúc. Phản ứng phiên mã ngược chuyển RNA thành cDNA. Sau đó cDNA được khuếch đại theo cấp số nhân. Mẫu dò huỳnh quang phát tín hiệu trong từng chu kỳ. Tín hiệu tỷ lệ với lượng vi rút ban đầu. Giá trị Ct phản ánh nồng độ vi rút trong mẫu. Ct thấp tương ứng với tải lượng vi rút cao. Nghiên cứu xây dựng quy trình riêng cho HEV và HAstV. Tổ hợp mồi và mẫu dò được lựa chọn kỹ lưỡng. Vùng gen đích có tính bảo tồn cao. Đường chuẩn được thiết lập từ RNA tổng hợp in vitro. Độ nhạy, độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện được đánh giá. Quy trình đạt yêu cầu cho xét nghiệm thực tế. Kết quả tương đồng với tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013.
3.1. Lựa chọn mồi và mẫu dò vùng gen bảo tồn
Mồi gắn vào vùng gen ổn định của vi rút. Vùng bảo tồn ít biến đổi giữa các chủng. Mẫu dò huỳnh quang nhận diện đoạn đặc hiệu. Nhiệt độ nóng chảy của mồi được hiệu chỉnh. Phần mềm hỗ trợ thiết kế trình tự. Mồi được kiểm tra tính đặc hiệu in silico. Phản ứng tránh khuếch đại không mong muốn. Tổ hợp tối ưu cho tín hiệu mạnh và rõ.
3.2. Xây dựng đường chuẩn từ RNA tổng hợp in vitro
Vùng gen đích được tách dòng vào vector. Phiên mã in vitro tạo ra RNA chuẩn. Nồng độ RNA được xác định chính xác. Dãy pha loãng bậc mười được chuẩn bị. Mỗi điểm pha loãng cho một giá trị Ct. Đường chuẩn biểu diễn quan hệ giữa Ct và nồng độ. Hệ số tương quan xác nhận độ tuyến tính. Đường chuẩn cho phép định lượng tuyệt đối.
3.3. Tối ưu chu trình nhiệt rút gọn cho xét nghiệm nhanh
Chu trình nhiệt theo ISO khá dài. Thời gian phân tích kéo dài nhiều giờ. Nghiên cứu thiết kế chu trình nhiệt rút gọn. Thời gian phản ứng giảm đáng kể. Độ nhạy vẫn được duy trì. Kết quả hai chu trình tương đồng nhau. Chu trình rút gọn phù hợp xét nghiệm nhanh. Phòng thí nghiệm tiết kiệm thời gian và chi phí.
IV. Ứng dụng công nghệ MGB và LNA tối ưu mồi và mẫu dò
Độ đặc hiệu là thách thức lớn của Real-time RT-PCR. Mồi và mẫu dò ngắn dễ giảm hiệu quả. Nhiệt độ nóng chảy thấp gây bắt cặp sai. Công nghệ MGB và LNA giải quyết vấn đề này. Cả hai làm tăng nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò. Liên kết với gen đích trở nên bền chặt hơn. Mẫu dò ngắn vẫn duy trì độ đặc hiệu cao. Tín hiệu huỳnh quang sạch và ổn định. Nghiên cứu áp dụng các công nghệ này cho vi rút mục tiêu. Khả năng phân biệt chủng được cải thiện. Phản ứng hoạt động tốt với vùng gen biến đổi. Kết quả phát hiện chính xác hơn. Các công nghệ này nâng cao chất lượng tổng thể của quy trình. Ứng dụng phù hợp với phòng thí nghiệm hiện đại.
4.1. Công nghệ MGB tăng nhiệt độ nóng chảy mẫu dò
MGB viết tắt của Minor Groove Binders. Phân tử gắn vào rãnh nhỏ của chuỗi xoắn kép. Liên kết này ổn định cấu trúc lai. Nhiệt độ nóng chảy tăng lên rõ rệt. Mẫu dò có thể thiết kế ngắn hơn. Mẫu dò ngắn nhận diện đoạn đặc hiệu tốt. MGB giảm tín hiệu nền. Phản ứng cho kết quả rõ ràng và đáng tin.
4.2. Công nghệ LNA cải thiện độ bền liên kết
LNA viết tắt của Locked Nucleic Acids. Cấu trúc nucleotide bị khóa cứng. Liên kết với chuỗi bổ sung rất bền. Nhiệt độ nóng chảy tăng cho mỗi base LNA. Mồi LNA bắt cặp chính xác hơn. Công nghệ này phân biệt khác biệt một nucleotide. LNA hữu ích cho vùng gen biến đổi. Độ đặc hiệu phản ứng được nâng cao.
4.3. So sánh hiệu quả MGB và LNA trong phản ứng
Cả hai công nghệ đều tăng nhiệt độ nóng chảy. MGB tối ưu cho đầu mẫu dò. LNA linh hoạt ở nhiều vị trí trình tự. Chi phí tổng hợp khác nhau giữa hai loại. Hiệu quả phụ thuộc vào trình tự gen đích. Nghiên cứu đánh giá cả hai lựa chọn. Kết quả định hướng thiết kế tối ưu. Phòng thí nghiệm chọn công nghệ phù hợp mục tiêu.
V. Xác định kiểu gen vi rút bằng Nested RT PCR và Sanger
Phát hiện vi rút mới là bước đầu tiên. Xác định kiểu gen mang ý nghĩa dịch tễ sâu hơn. Kiểu gen cho biết nguồn gốc và đường lây. Dữ liệu hỗ trợ truy vết các vụ bùng phát. Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật Nested RT-PCR. Kỹ thuật này khuếch đại vùng gen định danh. Hai vòng phản ứng tăng độ nhạy mạnh mẽ. Sản phẩm khuếch đại được giải trình tự Sanger. Trình tự thu được so sánh với ngân hàng gen. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng. Các chủng vi rút được phân nhóm theo kiểu gen. Kết quả cho thấy sự đa dạng di truyền. Dữ liệu phản ánh tình hình lưu hành tại Việt Nam. Thông tin này phục vụ giám sát và phòng ngừa.
5.1. Kỹ thuật Nested RT PCR khuếch đại vùng định danh
Nested RT-PCR gồm hai vòng khuếch đại. Vòng đầu dùng cặp mồi ngoài. Vòng hai dùng cặp mồi trong. Mồi trong nằm bên trong sản phẩm vòng đầu. Cấu trúc này tăng độ nhạy phát hiện. Mẫu có tải lượng thấp vẫn cho kết quả. Vùng gen định danh được khuếch đại đủ lượng. Sản phẩm sẵn sàng cho bước giải trình tự.
5.2. Giải trình tự Sanger và phân tích kiểu gen
Giải trình tự Sanger đọc thứ tự nucleotide. Mỗi base phát một tín hiệu màu riêng. Trình tự được hiệu chỉnh và làm sạch. Phần mềm so sánh với cơ sở dữ liệu chuẩn. Kiểu gen được xác định qua mức tương đồng. Cây phát sinh chủng loại minh họa quan hệ. Các chủng được phân nhóm rõ ràng. Kết quả định danh chính xác từng chủng vi rút.
5.3. Đa dạng kiểu gen vi rút lưu hành tại Việt Nam
Nhiều kiểu gen được phát hiện trong mẫu. Sự đa dạng phản ánh nguồn lây phức tạp. Một số kiểu gen phổ biến trên thế giới. Một số ít gặp tại khu vực. Dữ liệu bổ sung bản đồ dịch tễ phân tử. Kết quả hỗ trợ đánh giá nguy cơ. Cơ quan quản lý có thêm cơ sở cảnh báo. Nghiên cứu lấp khoảng trống dữ liệu trong nước.
VI. Ý nghĩa khoa học và ứng dụng an toàn thực phẩm thủy sản
Nghiên cứu mang giá trị khoa học và thực tiễn rõ rệt. Quy trình Real-time RT-PCR cho HEV và HAstV là điểm mới. Chu trình nhiệt rút gọn rút ngắn thời gian xét nghiệm. Công nghệ MGB và LNA nâng cao độ đặc hiệu. Dữ liệu kiểu gen bổ sung hiểu biết dịch tễ phân tử. Phương pháp đạt chuẩn quốc tế ISO 15216. Phòng thí nghiệm trong nước có thể áp dụng ngay. Cơ quan quản lý kiểm soát chất lượng thủy sản tốt hơn. Doanh nghiệp xuất khẩu đáp ứng yêu cầu thị trường khắt khe. Người tiêu dùng được bảo vệ trước nguy cơ ngộ độc. Kết quả góp phần bảo đảm an toàn thực phẩm. Nghiên cứu tạo nền tảng cho giám sát vi rút lâu dài. Hướng phát triển mở rộng sang các nền mẫu khác.
6.1. Đóng góp mới về quy trình phân tích vi rút
Quy trình phát hiện HEV và HAstV được xây dựng hoàn chỉnh. Chu trình nhiệt rút gọn là cải tiến đáng kể. Công nghệ mồi và mẫu dò tiên tiến được tích hợp. Phương pháp đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Dữ liệu kiểm chứng đầy đủ. Quy trình tuân thủ chuẩn quốc tế. Đóng góp này có giá trị ứng dụng rộng. Nghiên cứu bổ sung công cụ kiểm nghiệm mới.
6.2. Ứng dụng kiểm soát an toàn thực phẩm thủy sản
Phương pháp phục vụ kiểm nghiệm thường quy. Cơ sở nuôi trồng giám sát chất lượng nước. Doanh nghiệp kiểm tra sản phẩm trước xuất khẩu. Cơ quan chức năng cảnh báo nguy cơ sớm. Quy trình nhanh hỗ trợ ra quyết định kịp thời. Người tiêu dùng được bảo vệ tốt hơn. Niềm tin vào thủy sản trong nước tăng lên. Ứng dụng mang lại lợi ích kinh tế và sức khỏe.
6.3. Hướng nghiên cứu mở rộng trong tương lai
Phương pháp có thể mở rộng sang nền mẫu khác. Rau quả tươi cũng mang nguy cơ nhiễm vi rút. Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt là hướng tiềm năng. Giải trình tự thế hệ mới tăng độ phân giải. Giám sát định kỳ tạo dữ liệu dài hạn. Hợp tác liên ngành nâng cao hiệu quả. Nghiên cứu mở ra nhiều cơ hội phát triển. Nền tảng hiện tại hỗ trợ các bước tiếp theo.
Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung
Tải đầy đủ (199 trang)Trích đoạn nội dung luận án
Tải xuống để đọc toàn bộBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phan Thị Thanh Hà NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ VI RÚT CÓ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trương Tuyết Mai Hà Nội - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố.
Tập thể hướng dẫn Tác giả của luận án TS. Lê Quang Hòa Phan Thị Thanh Hà i LỜI CẢM ƠN Từ năm 2005 đến nay, trong những năm học Đại học, làm luận văn Thạc sĩ và luận án Tiến sĩ tại Đại học Bách khoa Hà Nội thân yêu, tôi đã thu nhận được rất nhiều kiến thức quý báu về lý thuyết cũng như thực hành nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ Sinh học – công nghệ Thực phẩm. Tôi vô cùng biết ơn các Thầy Cô giáo, Ban Giám hiệu, các cán bộ tại Phòng thí nghiệm, Ban Đào tạo, Ban Tài chính – Kế hoạch …đã dạy dỗ, bảo ban giúp đỡ tôi về mọi mặt. Hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dành nhiều thời gian trao đổi, định hướng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu cũng như viết Luận án. Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, Ban Đào tạo đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện và báo cáo đề tài Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh dưỡng, lãnh đạo và các đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực phẩm và Sinh học phân tử đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành công việc chuyên môn được phân công. Lời cảm ơn sâu sắc xin gửi tới Gia đình, Bạn bè luôn chia sẻ khó khăn, động viên khích lệ tôi vượt qua mọi trở ngại để hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu và học tập! Hà Nội ngày tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Phan Thị Thanh Hà ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .II MỤC LỤC.
III DANH MỤC CÁC HÌNH. VI DANH MỤC CÁC BẢNG. VI DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT. Tính cấp thiết của đề tài.
Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Tính mới của đề tài.
Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.
Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút. Các phương pháp xác định vi rút. Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR.
Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi, mẫu dò trong phản ứng Real – time RT - PCR. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders). Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids). Phương pháp xác định kiểu gen vi rút.
Kỹ thuật Nested RT - PCR. Kỹ thuật giải trình tự Sanger. Tình hình nghiên cứu sự lưu hành các kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV trên thế giới và tại Việt Nam. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.
Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu kiểm soát.
Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Phương pháp nghiên cứu. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.
Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT- PCR phát hiện HEV.
Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013.
Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT- PCR phát hiện HAstV. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013.
Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016.
Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2022. So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.
Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 133 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN.
135 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 136 PHỤ LỤC 1 KẾT QUẢ BỔ TRỢ CỦA LUẬN ÁN. 1 PHỤ LỤC 2 SẢN PHẨM CỦA LUẬN ÁN. 13 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.
Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 .3 Cấu tạo khung đọc mở NoV .4 Cấu trúc virion Hepatitis A virus .5 Cấu trúc hệ gen Hepatitis A virus .6 Cấu trúc virion Hepatitis E virus .7 Cấu trúc hệ gen Hepatitis E virus .8 Cấu trúc virion HAstV.9 Cấu trúc hệ gen HAstV.10 Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP .11 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR .12 Vị trí gắn của MGB trên mẫu dò và cấu trúc hóa học của MGB .13 Cấu trúc của nucleotide thông thường và của nucleotidd LNA (B) .14 Nguyên lý kỹ thuật Nested RT - PCR .15 Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự Sanger. Quy trình lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV và HAstV. Quy trình tách dòng trình tự gen đại diện của HEV và HAstV. Quy trình phiên mã in vitro tạo chứng dương RNA.
Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV. Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV. Tóm tắt quy trình phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV. Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013.
Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR với mồi ngoài khuếch đại RNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV. Cấu trúc hệ gen chuẩn HEV của WHO (mã số AB630970). Đặc điểm bộ mồi của Schlosser và của Jothikumar trên trình tự gen HEV chuẩn của WHO (mã số AB630970).
Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Schlosser và Jothikumar với các hệ gen HEV công bố trên GenBank. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV-A trên gel agarose. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích HEV.A sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose 2,5%.
Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV.B trên gel agarose. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích HEV.B sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose.
Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV. Chu trình nhiệt rút gọn của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV.
Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Cann và cộng sự. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HAstV trên gel agarose. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích HAstV sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose.
Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử dụng chu trình nhiệt theo ISO .
Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ
Câu hỏi thường gặp
Luận án "Phương pháp phân tích vi rút cao cấp trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ" nghiên cứu về vấn đề gì?
Nghiên cứu phương pháp phân tích nhanh vi rút nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm di truyền của chúng.
Luận án "Phương pháp phân tích vi rút cao cấp trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ" được bảo vệ tại trường nào?
Luận án này được bảo vệ tại Đại học Bách khoa Hà Nội. Năm bảo vệ: 2023.
Luận án "Phương pháp phân tích vi rút cao cấp trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ" thuộc chuyên ngành gì?
Luận án "Phương pháp phân tích vi rút cao cấp trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ" thuộc chuyên ngành Công nghệ Sinh học. Danh mục: Vi Sinh Vật Học.
Luận án "Phương pháp phân tích vi rút cao cấp trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ" có bao nhiêu trang?
Luận án "Phương pháp phân tích vi rút cao cấp trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ" có 199 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.
Cách tải luận án "Phương pháp phân tích vi rút cao cấp trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ" về máy như thế nào?
Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.