Luận án tiến sĩ: Đặc điểm kháng kháng sinh Salmonella đa kháng, gen liên quan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THANH VIỆT NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2020 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …….***………… NGUYỄN THANH VIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã sỗ: 9 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học: 1. Nghiêm Ngọc Minh 2. Võ Thị Bích Thủy Hà Nội – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan.

Các kết quả nghiên cứu này đã được công bố trên các tạp chí quốc tế và tạp chí chuyên ngành trong nước với sự đồng ý của các đồng tác giả. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào của tác giả khác. Tác giả luận án Nguyễn Thanh Việt Lời cảm ơn Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin cảm ơn GS. Nghiêm Ngọc Minh, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Hệ gen và PGS.

Võ Thị Bích Thủy, Phó Trưởng phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y, Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng đã tạo điều kiện cho tôi được học tập tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại viện. Nguyễn Thị Thanh Ngân, chuyên viên đào tạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi hoàn thành những thủ tục cần thiết trong quá trình học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học. Tôi xin cảm ơn Khoa xét nghiệm, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác, Học viện Quân y đã giúp tôi thực hiện một số thí nghiệm trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn TS. Moreland Gibbs, Trung tâm hỗ trợ phần mềm Genenious, New Zealand, đã giúp đỡ tôi trong quá trình phân tích số liệu.

Cảm ơn các đồng nghiệp đã đóng góp, giúp đỡ tôi hoàn thiện luận án của mình. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thanh Việt DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tên tiếng việt AM Ampicillin BHI Brain Heart Infusion Broth Canh thang BHI C Chloramphenicol CAZ Ceftazidime CIP Ciprofloxacin DNA Deoxyribonucleic Acid Axit đêôxiribônuclêic RNA Ribonucleic Acid Axit ribônuclêic GN Gentamycin GI Genomic Island KSĐ Kháng sinh đồ LCS Longest Contig Size Độ dài contig dài nhất LPS Lipopolysaccharide MDR Multidrug Resistance Đa kháng kháng sinh MSS Mean Sequence Size Kích thước trung bình của trình tự NC Number of Contigs Số lượng các contig NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới OMP Outer Membrane Protein Protein màng ngoài R Resistant Đề kháng S Sensitive Nhạy cảm STR Streptomycin SCS Shortest Contig Size Độ dài contig ngắn nhất SXT Sulfamethoxazol/Trimetoprim TE Tetracycline MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục các từ viết tắt Mục lục Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN.

Đặc điểm sinh học của Salmonella. Hình thái. Tính chất nuôi cấy. Tính chất hóa sinh.

Kháng nguyên. Kháng nguyên O. Kháng nguyên H. Kháng nguyên Vi.

Đặc điểm hệ gen của Salmonella. Cấu trúc hệ gen. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside.

Cơ chế kháng kháng sinh nhóm β-lactam. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm phenicol. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolone. Cơ chế kháng kháng sinh tetracycline.

Cơ chế kháng sulfonamide và trimethoprim. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc. Phân loại các loại kênh bơm thải thuốc.

Liên quan giữa kênh bơm thải thuốc và kháng kháng sinh ở Salmonella. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm. Trên thế giới. Tại Việt Nam.

Một số kỹ thuật hay được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen. Reverse transcription PCR (RT-PCR). Real-time PCR (qPCR). Giải trình tự thế hệ mới.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit. Môi trường, hóa chất phân lập Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002.

Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ. Kháng sinh. Thiết bị nghiên cứu. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Phương pháp lấy mẫu. Định danh Salmonella. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc. Tăng sinh chọn lọc.

Quy trình khẳng định. Kháng sinh đồ. Giải trình tự thế hệ mới. Tách chiết, tinh sạch RNA tổng số và thiết lập thư viện cDNA 42 2.

Giải trình tự thế hệ mới bằng công nghệ Illumina. Nhóm phương pháp tin sinh học. Kiểm tra chất lượng trình tự. Lọc trình tự chất lượng cao bằng phần mềm Trimmomatic [57].

Lắp ráp de novo. Chú thích hệ gen biểu hiện. Xác định các gen kháng kháng sinh. Xác định đột biến gen kháng kháng sinh.

Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger. Xử lý thống kê. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Phân lập và định danh type các chủng Salmonella nghiên cứu.

Kết quả phân lập Salmonella. Kết quả định danh type các chủng Salmonella phân lập được 56 3. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được.

Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập. Kiểu hình kháng kháng sinh. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.

Số lượng trình tự đọc (read). Lắp ráp de novo. Chú thích chức năng các gen. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu.

Nhóm gen kháng kháng sinh. Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone. Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc (efflux pump). Nhóm gen độc lực.

Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar. Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp Lipopolysaccharide (LPS) và thành tế bào. Nhóm gen đáp ứng với các chất gây độc. Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage.

Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger. 110 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 114 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.

115 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO. Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện cDNA bằng máy Bioanalyzer. Gen độc lực biểu hiện ở các mẫu nghiên cứu.

Biểu hiện của các gen liên quan đến flagellar. Các gen tổng hợp LPS và thành tế bào. Các gen liên quan đến các yếu tố di truyền vận động, phage, và prophage. Các gen liên quan đến tác động bất lợi của môi trường biểu hiện ở cả 6 mẫu nghiên cứu.

20 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1. Các gen kháng tetracycline [17]. Hệ thống kênh bơm thải thuốc và cơ chất ở Salmonella. Địa điểm lấy mẫu, số mẫu và ký hiệu mẫu.

Thành phần các môi trường và hóa chất sử dụng để định danh Salmonella. Thành phần môi trường BHI. Thành phần môi trường Muller Hinton. Kháng sinh sử dụng làm kháng sinh đồ.

Giải thích kết quả các phép thử khẳng định. Điểm phred và độ chính xác của trình tự [56]. Kết quả tăng sinh sơ bộ không chọn lọc và tăng sinh chọn lọc 90 mẫu nghiên cứu. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của 25 chủng vi khuẩn mọc được trên các môi trường tăng sinh chọn lọc.

Kết quả phân lập các chủng Salmonella ở các mẫu nghiên cứu. Danh sách các mẫu dương tính với Salmonella. Kết quả định danh type của các chủng Salmonella ở các mẫu nghiên cứu. Mức độ đề kháng kháng sinh của Salmonella phân lập được.

Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập. Kiểu hình kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được. Danh sách Salmonella đa kháng kháng sinh.

Nồng độ RNA tổng số của các mẫu nghiên cứu. Tóm tắt số lượng trình tự RNA của Salmonella. Kết quả lắp ráp de novo hệ gen biểu hiện của các Salmonella. Trình tự mã hóa ở 6 mẫu nghiên cứu.

Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu. Kết quả chi tiết các gen kháng kháng sinh biểu hiện ở các mẫu nghiên cứu. Kết quả xác định đột biến gen kháng kháng sinh nhóm quinolone. Kết quả xác định biểu hiển các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc ở các mẫu nghiên cứu.

Các gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC. 108 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1. Kháng nguyên của Salmonella [4]. Phân loại Salmonella [6].

Số lượng các gen chung và gen riêng ở một số loài Salmonella [8]. Cấu trúc hệ gen của S. Các kênh bơm thải thuốc ở Salmonella [23]. Vi khuẩn từ mẫu TB-1 trên môi trường MSRV.

Vi khuẩn từ các mẫu TL-1, 2, và TG-1 trên môi trường thạch XLD. Vi khuẩn từ các mẫu TB-1 và TL-1 trong thạch Kligler. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TB-1 trong môi trường ure. Vi khuẩn lập được từ mẫu TB-1, TL-1, 2 trong môi trường LDC.

Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TL-2 trong môi trường VP .