Luận án tiến sĩ nghiên cứu biểu hiện gen gmchi liên quan đến tổng hợp flavonoid

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƢ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) LUẬN N TIẾN S SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2019 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƢ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN N TIẾN S SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 2019 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trong các Tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chƣa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung và các số liệu đã trình bày trong luận án.

Thái Nguyên, ngày 12 tháng 3 năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Nhƣ Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã trực tiếp hƣớng dẫn và thƣờng xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để tôi có đƣợc sự tự tin và lòng đam mê khoa học giúp tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên.

Đƣợc học tập và sinh hoạt chuyên môn tại tập thể khoa học nghiêm túc, tôi đã nhận đƣợc nhiều góp ý quý báu, đƣợc trang bị thêm những phƣơng pháp nghiên cứu và có những hiểu biết sâu sắc hơn về các vấn đề của Sinh học hiện đại. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô và cán bộ phòng Đào tạo, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng tri ân đối với những ngƣời thầy, những đồng nghiệp, gia đình và bạn bè là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập của mình. Thái Nguyên, ngày 12 tháng 3 năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Nhƣ Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .v DANH MỤC CÁC BẢNG. viii DANH MỤC CÁC HÌNH. ix MỞ ĐẦU.

Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM. Cây Thổ nhân sâm. Nghiên cứu định danh cây Thổ nhân sâm.

Tái sinh in vitro ở cây Thổ nhân sâm. Nuôi cấy rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm. FLAVONOID VÀ CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở THỰC VẬT. Con đƣờng tổng hợp flavonoid ở thực vật.

ENZYME CHI VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHI. Nghiên cứu biểu hiện gen CHI. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.

Vật liệu thực vật. Chủng vi khuẩn và các loại vector. 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.

Hóa chất, thiết bị nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phƣơng pháp định danh mẫu cây Thổ nhân sâm.

Các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro. Phƣơng pháp chuyển gen GmCHI ở cây Thổ nhân sâm. Phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen. Các phƣơng pháp phân tích, xử lý số liệu.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU THỔ NHÂN SÂM. Đặc điểm hình thái các mẫu Thổ nhân sâm thu ở một số địa phƣơng. Đặc điểm trình tự nucleotide của vùng ITS và đoạn gen matK.

Thảo luận kết quả định danh mẫu Thổ nhân sâm trong tự nhiên. TẠO DÕNG THỔ NHÂN SÂM CHUYỂN GEN GmCHI. Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây Thổ nhân sâm. Kết quả chuyển gen GmCHI và tạo cây Thổ nhân sâm chuyển gen.

Kết quả phân tích cây Thổ nhân sâm chuyển gen. Thảo luận kết quả tạo dòng Thổ nhân sâm chuyển gen GmCHI. TẠO DÕNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM. Kết quả tạo dòng rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm.

Thảo luận kết quả tạo dòng rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm. 97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO .118 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com v DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AS Acetosyringone BAP Benzylaminopurine bp base pairs Cặp bazơ nitơ CCM Co-cultivation medium Môi trƣờng đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA bổ sung CHI Chalcone isomerase C4H Cinnamate 4-hydroxylase CHS Chalcone synthase 4CL 4-Coumarate CoA ligase cs Cộng sự CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide 2,4 D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid DFR Dihydroxyflavonol 4- reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate FAP Fatty-acid-binding proteins F3H Flavanone-3-hydroxylase ELISA Enzyme-linked Xét nghiệm ELISA immunosorbentassay FLS Flavonol synthase FNS II Flavone synthase II GA3 Gibberellic acid Axit gibberellic GM Germination medium Môi trƣờng nảy mầm GmCHI Glycine max chalcone LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt isomerase IAA Idole acetic acid Axit idole acetic IBA Idolbutylic acid Axit idolbutylic IFS Isoflavone synthase ITS Internal transcribed spacers Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn LDOX Leucoanthocyanidin oxygenase L-Tyr L-tyrosine Axit amin L-tyrosine mRNA Messenger ribonucleic acid RNA thông tin MS Murashige và Skoog, 1962 Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản nuôi cấy mô thực vật NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic OD Optical density Mật độ quang Ori Origin Điểm khởi đầu sao chép PAL Phenylalanine ammonia- lyase PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Ri-plasmid Root inducing- plasmid RM Rooting medium Môi trƣờng tạo rễ RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Rol Root locus Gen rol rpm Revolutions per minute Số vòng/ phút scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Shoot elongation medium Môi trƣờng kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Taq DNA Thermus aquaticus DNA LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vii Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt polymerase polymerase T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực vật TDZ Thidiazuron Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi trong ống nghiệm T1 Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1 TL-DNA Transfer left -DNA Vùng biên trái đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực vật TR-DNA Transfer right -DNA Vùng biên phải đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực vật UV Ultraviolet Tia cực tím Vir Virus interferon resistance Gen vir vvm Volume volume minute Thể tích khí/thể tích chất lỏng/ phút WPM Woody plant medium Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản nuôi cấy cây thân gỗ WT Wild type Cây không chuyển gen X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galacto-pyranoside ZT Zeatin LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com viii DANH MỤC C C BẢNG Bảng 2. Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu.

Sự sai khác về trình tự nucleotide của vùng ITS phân lập từ 5 mẫu Thổ nhân sâm so với T. paniculatum, mã số EU410357. Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ 5 mẫu Thổ nhân sâm so với T. paniculatum, mã số AY015274.

Ảnh hƣởng của javel 60 % và HgCl2 0,1 % đến t lệ nảy mầm của hạt 688 Bảng 3. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trƣởng chồi từ lá mầm. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trƣởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Ảnh hƣởng của tổ hợp 2 mg/l BAP và IBA đến sự phát sinh, sinh trƣởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên.

Ảnh hƣởng của IAA đến khả năng ra rễ của cây Thổ nhân sâm. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Thổ nhân sâm. Hiệu quả tạo đa chồi từ lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên sau khi lây nhiễm A. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm.

Hàm lƣợng flavonoid tổng số của hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen T1- 2.2; T1- 10 và cây đối chứng không chuyển gen. Kết quả khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ từ mô lá Thổ nhân sâm.

Xác định ngƣỡng diệt khuẩn của cefotaxime sau 4 tuần. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sự tăng trƣởng rễ tơ Thổ nhân sâm 955 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Khung cơ bản của flavonoid. Khung cơ bản của hợp chất chalcone.

Các dạng dị vòng C của major flavonoid, isoflavonoid, neoflavonoid. Cấu trúc chung của nhóm major flavonoid. Cấu trúc chung của nhóm aurone. Con đƣờng phenylpropanoid.

Cấu trúc và các vị trí amino acid hoạt động của enzyme CHI. Sự gắn kết của 2S - naringenin với các vị trí hoạt động của CHI. Mạng lƣới liên kết hydro của phức hợp CHI - naringenin. Hình ảnh phân tử nƣớc nằm giữa (2S)-naringenin và Tyr 106 trong phức hợp CHI-naringenin.

Vị trí các gen GmCHI trong bản đồ gen. Mẫu cây Thổ nhân sâm thu tại thành phố Thái Nguyên. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301-GmCHI. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát.

Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm qua nách lá mầm533 Hình 3. Cây Thổ nhân sâm. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân vùng ITS. Sơ đồ vùng ITS ở mẫu Thổ nhân sâm .