Luận án: Nuôi cấy tế bào xạ đen (Ehretia asperula) in vitro thu nhận acid rosmarinic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ MỸ TRÂM NUÔI CẤY TẾ BÀO XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi) IN VITRO ĐỂ THU NHẬN SINH KHỐI CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ACID ROSMARINIC LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP. HỒ CHÍ MINH - NĂM 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ MỸ TRÂM NUÔI CẤY TẾ BÀO XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi) IN VITRO ĐỂ THU NHẬN SINH KHỐI CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ACID ROSMARINIC Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 62420201 Phản biện độc lập: PGS. Nguyễn Vũ Phong Phản biện độc lập: PGS.

Trần Thanh Hương Phản biện: PGS. Nguyễn Thị Quỳnh Phản biện: PGS. Trịnh Ngọc Nam Phản biện: PGS. Lê Phi Nga NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1.

Lê Thị Thủy Tiên 2. Ngô Kế Sương LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.

Tác giả luận án Phạm Thị Mỹ Trâm i TÓM TẮT Cây xạ đen (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi) là một loại cây dược liệu quan trọng, chứa acid rosmarinic, là thành phần chính trong các hợp chất phenolic được phân lập, có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng oxy hóa, chống dị ứng, viêm khớp, hen suyễn và ức chế tế bào ung thư. Nghiên cứu “Nuôi cấy tế bào xạ đen (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi) in vitro để thu nhận sinh khối có khả năng tổng hợp acid rosmarinic” được thực hiện nhằm cung cấp các thông tin cần thiết cho việc tạo sinh khối thực vật chứa acid rosmarinic trong điều kiện có kiểm soát. Mô sẹo xốp hình thành từ lá in vitro và tăng trưởng tốt trên môi trường Gamborg (B5) bổ sung glucose 30 g/L, 2,4-D 0,4 mg/L và BA 0,1 mg/L, được sử dụng làm nguyên liệu tạo huyền phù tế bào. Sự tăng trưởng tốt nhất của tế bào huyền phù khi 1 g mô sẹo xốp được nuôi cấy trong 20 mL môi trường B5 lỏng bổ sung glucose 30 g/L, NAA 0,4 mg/L và BA 0,1 mg/L, trên máy lắc tròn với tốc độ lắc 90 vòng/phút, trong điều kiện tối trong 4 tuần.

Sinh khối và hàm lượng acid rosmarinic cao nhất khi nuôi cấy huyền phù tế bào trong tối với kích thước cụm tế bào không qua rây. Hàm lượng acid rosmarinic từ huyền phù tế bào được nuôi cấy trong môi trường bổ sung glucose 45 g/L cao gấp 1,2 lần so với khi sử dụng glucose 30 g/L. Chitosan được bổ sung vào môi trường nuôi cấy như tác nhân cảm ứng sự sinh tổng hợp acid rosmarinic. Chitosan 50 mg/L thúc đẩy huyền phù tế bào sản xuất acid rosmarinic sau 48 giờ cảm ứng, cao gấp 1,17 lần so với nghiệm thức không bổ sung chitosan.

Ngoài ra, hoạt tính của các cao chiết xạ đen được đánh giá với khả năng kháng oxy hóa và ức chế tế bào phôi thận lành tính (HEK293). Khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết được xếp theo thứ tự: cao chiết từ lá in vitro > cao chiết từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá in vitro > cao chiết từ lá ngoài vườn > cao chiết từ sinh khối tế bào huyền phù. Ở nồng độ dưới 400 µg/mL, các cao chiết xạ đen không có tác dụng gây độc đối với dòng tế bào HEK293. ii SUMMARY Ehretia asperula Zollinger et Moritzi is an important pharmaceutical plant, containing rosmarinic acid, the main component of the phenolic group, with many valuable biological activities such as antibacterial, antiviral, antioxidant, anti-allergy, arthritis, asthma and anti-cancer.

The study "Rosmarinic acid production in Ehretia asperula Zollinger et Moritzi cell cultures" aimed to produce acid rosmarinic through culturing cell suspensions under controlled conditions. Friable callus was successfully formed from leaves in vitro and on Gamborg (B5) medium supplemented with 30 g/L glucose, 0.1 mg/L BA, as a material for cell suspension cultures. The best cell suspension proliferation was achieved when 1 g of friable callus was cultured in 20 mL of liquid B5 medium supplemented with 30 g/L glucose, 0.1 mg/L BA and was rotated at 90 rpm on an orbital shaker under total darkness for 4 weeks. Cell aggregates are not sieved and are cultured in the dark for the highest biomass and rosmarinic acid content.

The content of rosmarinic acid in cell suspensions cultured in medium supplemented with 45 g/L glucose was 1.2 times higher than when 30 g/L glucose was used. Chitosan was added to the culture medium as an elicitor for rosmarinic acid biosynthesis. Chitosan 50 mg/L promoted the cell suspension to produce rosmarinic acid after 48 hours of treatment, 1.17 times higher than the treatment without chitosan. In addition, the activity of Ehretia asperula Zollinger et Moritzi extract was also verified through its ability to inhibit oxidation and HEK293 cells.

The antioxidant capacity of the extracts was ranked as: extract from leaf in vitro > extract from callus derived from leaf in vitro > extract from leaf in the garden > extract from suspension cell biomass. At concentrations below 400µg/mL, the extracts were not toxic to HEK293 cell. iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô PGS. Lê Thị Thủy Tiên và Thầy PGS.

Ngô Kế Sương đã tận tình định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên ngành và kinh nghiệm thực tiễn quý báu. Quý Thầy, Cô đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP.HCM đã nhiệt tình chỉ dẫn, hỗ trợ phương tiện, dụng cụ thí nghiệm và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài. Đồng thời, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, Viện Phát triển Ứng dụng, Trường Đại học Thủ Dầu Một đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất, phòng thí nghiệm và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận án.

Xin cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè và các em sinh viên đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ tôi hoàn thành luận án này. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người thầy vĩ đại đầu tiên đã chăm sóc, yêu thương, dạy dỗ và dìu dắt con vào đời. Con xin cảm ơn những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ và động viên con trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Nghiên cứu sinh Phạm Thị Mỹ Trâm iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CÁC BẢNG. xi DANH MỤC CÁC HÌNH. xiii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT. xvi MỞ ĐẦU.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu của luận án. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn.

Tính mới của luận án. Nội dung nghiên cứu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 Cây xạ đen .1 Nguồn gốc và phân loại .2 Đặc điểm sinh học của cây xạ đen.3 Hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây xạ đen .1 Tính chất lý hóa của acid rosmarinic .2 Con đường sinh tổng hợp acid rosmarinic ở thực vật .3 Thực vật giàu acid rosmarinic .4 Hoạt tính sinh học của acid rosmarinic .3 Hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật in vitro .1 Nuôi cấy mô sẹo .2 Nuôi cấy huyền phù tế bào .4 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình nuôi cấy tế bào thực vật .1 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình nuôi cấy mô sẹo .1 Nguyên liệu thực vật.2 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật .3 Môi trường khoáng .6 pH môi trường .2 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự thu nhận hợp chất thứ cấp từ hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật .1 Điều kiện môi trường.2 Dòng tế bào .3 Tiền chất hữu cơ .4 Sự kích kháng .5 Thu nhận acid rosmarinic từ các hệ thống tế bào thực vật in vitro .6 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô-tế bào xạ đen .1 Vi nhân giống cây xạ đen .2 Nuôi cấy tế bào xạ đen .7 Nhận xét chung. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 Vật liệu nghiên cứu.3 Địa điểm và thời gian thực hiện luận án .2 Phương pháp nghiên cứu .1 Vi nhân giống cây xạ đen .2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự tạo mô sẹo xạ đen .1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự tạo mô sẹo từ cây xạ đen ngoài vườn .2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự tạo mô sẹo từ cây xạ đen in vitro .3 Xác định sự hiện diện của hợp chất phenolic và hàm lượng acid rosmarinic trong cây và mô sẹo xạ đen .4 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của loại mô sẹo đến chất lượng nguyên liệu tạo huyền phù tế bào .5 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự gia tăng sinh khối và tích lũy acid rosmarinic của huyền phù tế bào xạ đen .1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự hình thành và tăng sinh của huyền phù tế bào .2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự tích lũy acid rosmarinic của huyền phù tế bào .6 Điều kiện hấp khử trùng và nuôi cấy.1 Điều kiện hấp khử trùng .2 Điều kiện nuôi cấy .7 Các phương pháp phân tích .1 Chỉ tiêu theo dõi .2 Xác định khối lượng mô sẹo tươi .3 Xác định tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo xốp và chỉ số tăng trưởng.4 Xác định sinh khối của huyền phù tế bào .5 Xác định sự hiện diện của hợp chất phenolic trong cây và mô sẹo xạ đen .6 Chiết xuất và định lượng acid rosmarinic .7 Khảo sát hoạt tính sinh học của các nguồn mẫu xạ đen .8 Xử lý số liệu.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1 Vi nhân giống cây xạ đen .2 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự tạo mô sẹo xạ đen .1 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự tạo mô sẹo từ cây xạ đen ngoài vườn .2 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự tạo mô sẹo từ cây xạ đen in vitro .3 Sự hiện diện của hợp chất phenolic và hàm lượng acid rosmarinic trong cây và mô sẹo xạ đen .1 Sự hiện diện của hợp chất phenolic .2 Hàm lượng acid rosmarinic .4 Ảnh hưởng của loại mô sẹo đến chất lượng nguyên liệu tạo huyền phù tế bào .5 Ảnh hưởng của một số yếu tốt lên sự gia tăng sinh khối và tích lũy acid rosmarinic của huyền phù tế bào xạ đen .