Luận án tiến sĩ: Lysyl oxidase tế bào nội mô võng mạc - 2020

Lysyl oxidase (LOX) là một amine oxidase phụ thuộc đồng. Enzyme này thuộc họ enzyme lysyl oxidase-like (LOXL) gồm năm thành viên: LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3 và LOXL4. Mỗi phân tử sở hữu đuôi C bảo tồn cao chứa vị trí gắn đồng và cofactor lysyl tyrosylquinone. Tiền chất pro-LOX có trọng lượng phân tử 50 kDa. Sau khi phân cắt ngoại bào, enzyme giải phóng dạng hoạt động 32 kDa. Họ enzyme LOXL tham gia kiểm soát cấu trúc mô liên kết khắp cơ thể. Tại mô võng mạc, LOX thể hiện hoạt tính sinh học nổi bật nhất. Protein này kiểm soát mật độ sợi nâng đỡ quanh mao mạch mắt. Biến đổi hoạt tính các thành viên trong họ LOXL làm thay đổi hình thái vi mạch nhanh chóng.

Chức năng chính của LOX là oxy hóa khử các gốc lysine và hydroxylysine trên phân tử cơ chất. Phản ứng tạo ra các aldehyde phản ứng tự do như allysine. Các nhóm aldehyde này tự phát ngưng tụ tạo thành liên kết cộng hóa trị bền vững. Quá trình này hoàn tất phản ứng liên kết chéo collagen và elastin (Cross-linking). Nhờ đó, các sợi collagen loại IV và elastin trưởng thành hình thành mạng lưới chịu lực vững chắc. Thiếu liên kết chéo, sợi chất nền dễ bị thoái hóa và đứt gãy. Ngược lại, dư thừa liên kết chéo làm xơ cứng thành mạch. Cân bằng động này duy trì tính đàn hồi tự nhiên của mao mạch võng mạc trước áp lực dòng máu.

Tế bào nội mô võng mạc (HREC) tổng hợp LOX tại lưới nội chất hạt. Protein sau đó di chuyển qua bộ máy Golgi và bài tiết ra màng tế bào. Enzyme định vị chủ yếu tại màng đáy và khoang gian bào bao quanh nội mô. Tại đây, LOX gắn kết chặt chẽ với các protein nền tảng như fibronectin và collagen. Sự phân bố này tạo giá đỡ sinh học vững chắc cho lớp tế bào nội mô bám dính. Ngoài ra, một lượng nhỏ enzyme tồn tại trong nhân và bào tương để điều hòa biểu hiện gen. Sự phân bố chính xác của LOX giúp tế bào tiếp nhận tín hiệu vi môi trường. Bất thường phân bố dẫn đến phá vỡ vi kiến trúc mao mạch.

Nghiên cứu thực nghiệm chứng minh môi trường nồng độ glucose cao kích thích tăng biểu hiện cả mRNA lẫn protein LOX. Mức tăng đạt đỉnh sau thời gian ngắn nuôi cấy tế bào nội mô trong dung dịch glucose 25 mM. Kỹ thuật Western blot và Real-time PCR xác nhận sự gia tăng vượt bậc của pro-LOX 50 kDa và enzyme hoạt tính 32 kDa. Quá trình đường hóa nâng cao (AGEs) cùng các gốc tự do ROS kích thích yếu tố phiên mã đặc hiệu. Yếu tố phiên mã bám vào promoter gen LOX và thúc đẩy sao chép. Tình trạng tăng sinh enzyme kéo dài khiến nồng độ LOX tích tụ quá mức trong khoang ngoại bào. Hiện tượng này báo hiệu giai đoạn khởi đầu của bệnh lý mạch máu do đái tháo đường.

Glucose cao làm xáo trộn khả năng bám dính của tế bào nội mô võng mạc (HREC) vào chất nền. Dù lượng enzyme LOX gia tăng, mật độ bám dính chức năng của enzyme với fibronectin và collagen lại sụt giảm. Cấu trúc các thụ thể integrin trên màng tế bào bị biến đổi do quá trình glycat hóa. Tế bào nội mô mất điểm tựa cơ học, dễ bong tróc khỏi khung nâng đỡ. Thử nghiệm gắn kết cho thấy tỷ lệ tế bào bám dính giảm rõ rệt theo thời gian tiếp xúc đường cao. Tình trạng mất bám dính kích hoạt con đường chết theo chương trình apoptosis của tế bào nội mô. Số lượng tế bào sống sót giảm sút tạo ra các vùng mao mạch vô bào rải rác trên võng mạc.

Tế bào nội mô võng mạc liên kết với nhau qua các phức hợp tiếp hợp chặt và tiếp hợp khe. Môi trường glucose cao ức chế biểu hiện các protein kết nối quan trọng như Connexin 43 (Cx43) và Occludin. Đồng thời, sự tích tụ LOX bất thường làm biến đổi cấu trúc protein màng. Khe hở giữa các tế bào nội mô lân cận rộng ra đáng kể. Khả năng truyền dẫn tín hiệu hóa học và điện học gian bào bị gián đoạn hoàn toàn. Tế bào không còn duy trì được tính đồng nhất sinh lý trong toàn bộ mạng lưới mạch. Tế bào nội mô suy yếu, phình giãn bất thường và hình thành các vi phình mạch đặc trưng của bệnh lý võng mạc.

Màng đáy vi mạch võng mạc (Retinal capillary basement membrane) dày lên rõ rệt dưới kính hiển vi điện tử. Hoạt tính oxy hóa của LOX thúc đẩy tạo liên kết chéo collagen loại IV và laminin dày đặc. Mạng lưới sợi protein đan xen chằng chịt và không bị phân hủy bởi các men metalloproteinase (MMPs). Sự tích tụ vật chất chất nền vượt quá tốc độ thanh thải tự nhiên của mô. Màng đáy dày gấp hai đến ba lần so với kích thước vi thể thông thường. Sự phì đại này làm lòng mao mạch hẹp dần, hạn chế lưu lượng hồng cầu đi qua. Các tế bào quang cảm thụ phía sau rơi vào tình trạng thiếu dưỡng chất cục bộ kéo dài.

Tái cấu trúc chất nền ngoại bào (ECM remodeling) bình thường cần sự cân bằng giữa tổng hợp và thoái biến. Tuy nhiên, nồng độ glucose cao kích thích LOX hoạt động không kiểm soát. Liên kết chéo collagen và elastin (Cross-linking) dày đặc bảo vệ chất nền khỏi sự cắt tỉa enzym sinh học. Tỷ lệ fibronectin, collagen và heparan sulfate proteoglycan (HSPGs) bị biến đổi trầm trọng. Sự suy giảm HSPGs làm mất điện tích âm tự nhiên của màng đáy vi mạch. Khung nền ECM trở nên trơ cứng, tích tụ nhiều phân tử protein kết tụ bất thường. Cấu trúc siêu vi của nền mạch máu bị phá hủy, thúc đẩy phản ứng viêm mô mạn tính tại chỗ.

Sự tích tụ quá mức các phân tử protein sợi làm thay đổi đặc tính cơ học của mao mạch võng mạc. Thành mạch mất độ co giãn sinh lý trước các dao động huyết áp cục bộ. Độ cứng thành mạch tăng cao gây tổn thương ứng suất cắt lên tế bào nội mô. Đồng thời, các tế bào quanh mạch (pericytes) bị tách rời khỏi màng đáy xơ cứng. Hiện tượng chết tế bào quanh mạch diễn ra nhanh chóng, làm mất khả năng điều hòa vận mạch tự động. Mạch máu trở nên giòn, dễ gãy và mất khả năng bù trừ huyết động. Đây là biến đổi mô học then chốt dẫn đến vỡ mạch và xuất huyết võng mạc.

Hàng rào máu - võng mạc (Blood-retinal barrier - BRB) gồm hai thành phần: hàng rào trong và hàng rào ngoài. Tế bào nội mô mao mạch võng mạc tạo nên hàng rào trong nhờ các liên kết siết chặt chẽ. Khi LOX tăng cao và phân bố sai lệch, các protein liên kết màng bị tiêu biến. Khoảng hở gian bào mở rộng cho phép các chất dịch đi qua tự do. Thử nghiệm nhuộm Fluorescein isothiocyanate (FITC)-BSA cho thấy lượng phân tử thoát mạch tăng gấp nhiều lần. Cùng lúc đó, các tế bào hỗ trợ như tế bào hình sao và tế bào thần kinh đệm Muller bị kích hoạt viêm. Hàng rào BRB mất hoàn toàn tính nguyên vẹn sinh học.

Hiện tượng tăng tính thấm thành mạch (Vascular hyperpermeability) dẫn đến tích tụ dịch không mong muốn trong các lớp võng mạc. Dịch rò rỉ tập trung chủ yếu tại vùng hoàng điểm, gây phù hoàng điểm đái tháo đường (DME). Áp lực thẩm thấu ngoại bào tăng cao làm biến dạng các tế bào nón và tế bào que. Bệnh nhân bắt đầu xuất hiện triệu chứng nhìn mờ, méo hình và giảm thị lực trung tâm nhanh chóng. Nếu không kiểm soát kịp thời, các bọc nang chứa dịch sẽ phá vỡ liên kết thần kinh cảm thụ. Phù hoàng điểm kéo dài dẫn đến teo tế bào thần kinh võng mạc và suy giảm thị giác vĩnh viễn không thể hồi phục.

Tổn thương mao mạch kéo dài thúc đẩy tiến triển nhanh chóng sang bệnh võng mạc đái tháo đường (Diabetic retinopathy). Mao mạch bị tắc nghẽn tạo ra các vùng thiếu máu và thiếu oxy võng mạc diện rộng. Mô võng mạc thiếu oxy kích hoạt yếu tố phiên mã HIFs và tăng tiết yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF). Nồng độ VEGF cao kích thích hình thành các tân mạch bất thường, chuyển bệnh sang thể tăng sinh (PDR). Các tân mạch mới sinh có cấu trúc mỏng manh, rất dễ vỡ gây xuất huyết dịch kính. Tình trạng xơ hóa dịch kính võng mạc co kéo có thể gây bong võng mạc và mù lòa hoàn toàn.

Hợp chất beta-aminopropionitrile (BAPN) là chất ức chế cạnh tranh kinh điển đối với hoạt tính xúc tác của LOX. Trong môi trường nuôi cấy glucose cao, BAPN làm giảm đáng kể mức độ liên kết chéo collagen bất thường. Song song đó, công nghệ can thiệp RNA sử dụng LOX small interfering RNA (LOXsiRNA) giúp ức chế đặc hiệu biểu hiện gen LOX. Kỹ thuật Western blot chứng minh LOXsiRNA làm giảm nồng độ protein LOX nội bào về mức tương đương nhóm chứng sinh lý. Sự kết hợp các biện pháp ức chế này giúp ngăn ngừa tình trạng dày màng đáy vi mạch hiệu quả. Đồng thời, tỷ lệ tế bào nội mô sống sót tăng lên rõ rệt trong các mô hình thử nghiệm.

Kiểm soát hoạt tính LOX chứng minh tiềm năng bảo vệ cấu trúc vi mạch võng mạc toàn diện trước độc tính của glucose. Khi LOX được duy trì ở mức sinh lý, độ bám dính của tế bào nội mô võng mạc (HREC) vào chất nền được khôi phục. Các phức hợp liên kết khe và liên kết siết duy trì được tính toàn vẹn cấu trúc. Hàng rào máu - võng mạc (BRB) giữ vững chức năng ngăn chặn hiện tượng rò rỉ dịch huyết tương. Hiện tượng tăng tính thấm thành mạch (Vascular hyperpermeability) giảm thiểu rõ rệt, ngăn chặn sự hình thành phù hoàng điểm. Nhờ đó, tính đàn hồi và khả năng tự điều hòa của mao mạch mắt được bảo tồn bền vững.

Ức chế chọn lọc LOX và họ enzyme lysyl oxidase-like (LOXL) đặt nền móng cho các phác đồ điều trị nhãn khoa hiện đại. Thay vì chỉ tiêm kháng VEGF khi tân mạch đã xuất hiện, can thiệp sớm vào LOX giúp ngăn chặn tổn thương ngay từ gốc rễ. Các hạt nano vận chuyển thuốc nhắm đích hoặc liệu pháp gen đưa LOXsiRNA vào mắt đang được tối ưu hóa. Phương pháp này giảm thiểu tác dụng phụ toàn thân của các chất ức chế hóa học. Sự phối hợp giữa kiểm soát đường huyết và điều hòa vi môi trường LOX hứa hẹn nâng cao hiệu quả phòng ngừa bệnh võng mạc đái tháo đường. Đây là bước tiến quan trọng trong y học chính xác ứng dụng cho thị giác.