Luận án tiến sĩ: Chức năng sinh học túi LxCxE của protein Retinoblastoma

Pocket domain là vùng chức năng chính của protein Retinoblastoma. Vùng này gồm hai phần: A/B pocket và C-terminal domain. Túi kết dính LxCxE nằm trong A/B pocket. Motif LxCxE bao gồm các amino acid Leucine-X-Cysteine-X-Glutamate. Cấu trúc này tạo thành khe liên kết đặc hiệu. Nhiều protein virus như Adenovirus E1A nhận diện và liên kết với motif này. Tương tác này vô hiệu hóa chức năng ức chế khối u của pRb. Đột biến N750F làm thay đổi cấu trúc không gian của túi kết dính. Sự thay đổi này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng liên kết với protein chứa motif LxCxE.

RB protein kiểm soát pha G1/S của chu kỳ tế bào thông qua nhiều cơ chế. Túi kết dính LxCxE tham gia điều hòa hoạt động của E2F transcription factor. Khi tế bào ở trạng thái nghỉ, pRb liên kết và ức chế E2F. Sự liên kết này ngăn chặn biểu hiện các gen cần thiết cho pha S. Phosphorylation của pRb làm giải phóng E2F, cho phép tế bào tiến vào pha S. Túi LxCxE cũng tương tác với các enzyme sửa đổi chromatin. Các tương tác này ảnh hưởng đến cấu trúc nhiễm sắc thể và biểu hiện gen. Mất chức năng của túi kết dính dẫn đến mất kiểm soát tăng trưởng tế bào.

Protein virus sử dụng motif LxCxE để vô hiệu hóa pRb. Adenovirus E1A là ví dụ điển hình của cơ chế này. E1A liên kết với túi kết dính LxCxE và phá vỡ phức hợp pRb-E2F. Điều này giải phóng E2F và kích hoạt biểu hiện gen pha S. Tế bào nhiễm virus do đó bị buộc vào chu kỳ phân chia. HPV E7 và SV40 Large T antigen cũng sử dụng cơ chế tương tự. Nghiên cứu đột biến N750F cho thấy tầm quan trọng của túi kết dính. Đột biến này làm mất khả năng liên kết với E1A nhưng vẫn giữ các chức năng khác của pRb.

Quá trình tạo chuột RbN750F sử dụng phương pháp recombineering. Targeting construct chứa đột biến N750F được thiết kế cẩn thận. Cassette Neo được chèn vào để chọn lọc tế bào ES dương tính. Tế bào ES được transfection và screening bằng PCR. Các clone mang đột biến đúng được tiêm vào blastocyst. Chuột chimera sinh ra được lai để kiểm tra germ line transmission. Cassette Neo sau đó được loại bỏ bằng hệ thống Cre-loxP. Genotyping PCR xác nhận sự hiện diện của allele RbN750F. Dòng chuột được duy trì trên nền di truyền 129/B6 mixed background.

Phân tích di truyền cho thấy allele RbN750F tuân theo quy luật Mendel. Tỷ lệ chuột con mang các kiểu gen khác nhau phù hợp với dự đoán lý thuyết. Chuột RbN750F/N750F sinh ra với tần suất bình thường từ phép lai Rb+/N750F x Rb+/N750F. Điều này chứng tỏ đột biến không gây chết phôi. Tuy nhiên, phép lai tạo chuột RbN750F/- cho kết quả khác biệt. Tỷ lệ chuột RbN750F/- sinh ra thấp hơn dự đoán Mendelian. Một số phôi mang kiểu gen này chết trong giai đoạn phát triển. Những chuột RbN750F/- sống sót có tuổi thọ giảm và khối lượng cơ thể thấp.

Mô hình chuột RbN750F cung cấp công cụ độc đáo để nghiên cứu chức năng pRb. Các nghiên cứu trước đây sử dụng chuột knockout Rb hoàn toàn. Chuột Rb-/- chết phôi do khuyết tật nghiêm trọng. Mô hình RbN750F cho phép nghiên cứu chuột sống với đột biến đặc hiệu. Điều này giúp phân biệt chức năng phụ thuộc và độc lập với túi LxCxE. Mô hình cũng cho phép nghiên cứu vai trò của túi kết dính trong các mô khác nhau. Phân tích phenotype của chuột RbN750F/N750F và RbN750F/- tiết lộ thông tin quan trọng. Kết quả cho thấy túi LxCxE không cần thiết cho một số chức năng của pRb.

Thí nghiệm co-immunoprecipitation xác nhận pRb-N750F không liên kết E1A. MEFs wild-type nhiễm Adenovirus cho thấy phức hợp pRb-E1A rõ ràng. MEFs RbN750F/N750F nhiễm virus không tạo phức hợp này. Kết quả này chứng minh đột biến N750F phá vỡ đặc hiệu túi LxCxE. Các tương tác khác của pRb không bị ảnh hưởng. Protein pRb-N750F vẫn liên kết bình thường với E2F. Phosphorylation của pRb-N750F diễn ra đúng theo chu kỳ tế bào. Điều này cho thấy đột biến chỉ ảnh hưởng đến tương tác phụ thuộc motif LxCxE.

Myoblasts RbN750F/N750F biệt hóa bình thường thành myotubes. Các myotubes này biểu hiện marker biệt hóa cơ như myosin heavy chain. Khi kích thích lại với serum, myotubes wild-type không tái nhập chu kỳ tế bào. Myotubes RbN750F/N750F cũng duy trì trạng thái biệt hóa terminal. Điều này khác biệt với myotubes nhiễm E1A. E1A buộc myotubes biệt hóa quay lại chu kỳ tế bào và tổng hợp DNA. Kết quả chứng tỏ túi LxCxE không cần thiết cho chức năng duy trì differentiation. pRb sử dụng cơ chế khác, độc lập với túi LxCxE, để giữ tế bào ở trạng thái biệt hóa.

MEFs RbN750F/N750F trải qua immortalization tự phát nhanh hơn wild-type. Quá trình này thường diễn ra sau 10-15 passages thay vì 20-25. Immortalization nhanh gợi ý một khuyết tật nhẹ trong kiểm soát tăng trưởng. Tuy nhiên, MEFs RbN750F/N750F vẫn đáp ứng contact inhibition bình thường. Khi đạt confluence, các tế bào này ngừng phân chia. Chu kỳ tế bào tiến triển bình thường qua các pha G1, S, G2 và M. Biểu hiện của cyclin và CDK không thay đổi bất thường. Các gen chu kỳ tế bào không bị deregulate như trong tế bào nhiễm E1A. Điều này cho thấy túi LxCxE tham gia một phần vào kiểm soát senescence.

Chuột đồng hợp tử RbN750F/N750F không có khuyết tật phát triển rõ rệt. Các mô được kiểm tra bao gồm cơ, máu, lách, và tuyến sinh dục. Cơ xương có cấu trúc sợi cơ bình thường với striations rõ ràng. Cơ tim có cardiomyocytes sắp xếp đều đặn. Phân tích complete blood count cho thấy hầu hết thông số bình thường. Số lượng red blood cells, white blood cells và hemoglobin trong giới hạn bình thường. Platelet counts giảm nhẹ ở một số cá thể nhưng không có ý nghĩa lâm sàng. Differentiation của megakaryocyte progenitors diễn ra bình thường. Kết quả này cho thấy túi LxCxE không cần thiết cho phát triển phôi và sau sinh.

Phân tích hệ miễn dịch của chuột RbN750F/N750F cho kết quả bình thường. Lymphocyte counts trong máu ngoại vi nằm trong khoảng chuẩn. Tỷ lệ T lymphocytes và B lymphocytes không thay đổi. Flow cytometry analysis xác nhận tỷ lệ các subpopulation lymphocyte bình thường. Lá lách có cấu trúc mô học bình thường. White pulp chứa lymphoid follicles với germinal centers. Red pulp có mật độ tế bào máu bình thường. Hematopoietic stem cells trong bone marrow phát triển và differentiate bình thường. Colony-forming assays cho thấy khả năng tạo colony bình thường. Kết quả chứng tỏ túi LxCxE không thiết yếu cho hematopoiesis và chức năng miễn dịch.

Chuột RbN750F/- mang một allele đột biến và một allele null. Những chuột này có phenotype nghiêm trọng hơn RbN750F/N750F. Tư thế gù lưng xuất hiện sớm và trở nên rõ rệt theo thời gian. Khối lượng cơ thể giảm đáng kể so với littermates wild-type. Tuổi thọ giảm với nhiều chuột chết trước 12 tháng tuổi. Buồng trứng của chuột cái RbN750F/- có bất thường histological. Số lượng follicles giảm và có dấu hiệu thoái hóa. Tinh hoàn của chuột đực RbN750F/- cũng có bất thường. Spermatogenesis bị ảnh hưởng với giảm số lượng sperm. Phenotype này cho thấy pRb cần một mức độ chức năng tối thiểu để duy trì sức khỏe.

Microarray analysis so sánh MEFs RbN750F/N750F với wild-type. Các gen E2F-responsive như cyclin E, cyclin A, DHFR biểu hiện bình thường. Mức độ mRNA của các gen này không tăng trong MEFs RbN750F/N750F. Northern blot và RT-PCR xác nhận kết quả microarray. Điều này tương phản với MEFs nhiễm E1A. E1A gây tăng mạnh biểu hiện của các gen chu kỳ tế bào này. Kết quả cho thấy pRb-N750F vẫn điều hòa E2F bình thường. Tương tác pRb-E2F không phụ thuộc vào túi LxCxE. pRb sử dụng vùng khác để liên kết và ức chế E2F. Chức năng kiểm soát pha G1/S do đó vẫn được duy trì.

Phân tích expression profile phát hiện deregulation của một số developmental genes. Các gen này bao gồm Hox genes và các transcription factors phát triển. Biểu hiện của những gen này thay đổi trong MEFs RbN750F/N750F. Sự thay đổi không lớn nhưng có ý nghĩa thống kê. Các gen này thường không được xem là E2F targets. Vai trò của chúng liên quan đến pattern formation và cell fate determination. Deregulation gợi ý pRb điều hòa các gen này thông qua túi LxCxE. Cơ chế có thể liên quan đến tương tác với chromatin modifiers. Histone deacetylases và methyltransferases chứa motif LxCxE. pRb có thể recruit các enzyme này đến promoter của developmental genes.

Túi kết dính LxCxE tương tác với nhiều chromatin-modifying enzymes. HDAC1, HDAC2 và HDAC3 chứa motif LxCxE. Các enzyme này deacetylate histones và làm ngưng tụ chromatin. pRb recruit HDACs đến promoter để ức chế transcription. SUV39H1 methyltransferase cũng tương tác với túi LxCxE. Enzyme này tạo H3K9 trimethylation, một repressive mark. Đột biến N750F làm mất các tương tác này. MEFs RbN750F/N750F có thể có thay đổi chromatin structure. Điều này giải thích deregulation của một số developmental genes. Tuy nhiên, tác động không đủ mạnh để gây phenotype phát triển nghiêm trọng.

Protein Retinoblastoma là protein ức chế khối u quan trọng. Mất chức năng pRb xảy ra trong nhiều loại ung thư. Retinoblastoma, osteosarcoma và lung cancer thường có đột biến RB1. Hiểu cơ chế hoạt động của pRb giúp phát triển liệu pháp. Kết quả nghiên cứu cho thấy túi LxCxE có vai trò chọn lọc. Chức năng kiểm soát chu kỳ tế bào cơ bản không phụ thuộc túi này. Điều này gợi ý có thể phát triển thuốc targeting đặc hiệu. Ức chế tương tác virus-pRb qua túi LxCxE có thể điều trị nhiễm trùng. Reactive các chức năng khác của pRb có thể ức chế ung thư.

Hiểu biết về cấu trúc túi LxCxE cho phép thiết kế thuốc nhỏ. Các molecule ức chế tương tác protein-protein có thể phát triển. Peptide mimetics của motif LxCxE có thể block tương tác với virus. Điều này bảo vệ pRb khỏi bị vô hiệu hóa bởi oncoprotein virus. Ngược lại, kích hoạt các chức năng độc lập với túi LxCxE có tiềm năng. Các molecule tăng cường tương tác pRb-E2F có thể ức chế tăng trưởng ung thư. Mô hình chuột RbN750F là công cụ quý giá để test các liệu pháp này. Preclinical studies có thể đánh giá hiệu quả và độ an toàn.

Nhiều câu hỏi về chức năng túi LxCxE vẫn chưa được giải đáp. Danh sách đầy đủ các protein tương tác cần được xác định. Proteomics approaches có thể identify các LxCxE-containing proteins mới. Vai trò của các tương tác này trong các mô khác nhau cần nghiên cứu. Mối liên hệ giữa túi LxCxE và epigenetic regulation cần làm rõ. ChIP-seq có thể map các vùng genome được điều hòa bởi túi này. Nghiên cứu cấu trúc 3D của phức hợp pRb-LxCxE protein giúp thiết kế thuốc. Phân tích phenotype của chuột RbN750F trong các mô hình bệnh khác nhau cần tiến hành. Kết hợp đột biến RbN750F với các đột biến ung thư khác có thể tiết lộ epistatic interactions.