Biểu hiện gen GmCHI trong tổng hợp flavonoid và tạo rễ tơ - Talinum paniculatum

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) LUẬN ÁN TIẾN SĨSINH HỌC THÁI NGUYÊN ­ 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨSINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN ­ 2019 4 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung và các số liệu đã trình bày trong luận án.

Thái Nguyên, ngày 12 tháng 3 năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Như Trang 5 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã trực tiếp hướng dẫn và thường xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để tôi có được sự tự tin và lòng đam mê khoa học giúp tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thanh ̉ ơn PGS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên cứu ̀ cam viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm ­ Đại học Thái Nguyên.

Được học tập và sinh hoạt chuyên môn tại tập thể khoa học nghiêm túc, tôi đã nhận được nhiều góp ý quý báu, được trang bị thêm những phương pháp nghiên cứu và có những hiểu biết sâu sắc hơn về các vấn đề của Sinh học hiện đại. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô và cán bộ phòng Đào tạo, Trường Đaị hoc̣ Sư pham ̣ ­ Đaị hoc̣ Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng tri ân đối với những người thầy, những đồng nghiệp, gia đình và bạn bè là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập của mình. Thái Nguyên, ngày 12 tháng 3 năm 2019 TÁC GIẢ 6 Vũ Thị Như Trang MỤC LỤC 7 ỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AS Acetosyringone BAP Benzylaminopurine bp base pairs Cặp bazơ nitơ CCM Co­cultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA bổ sung CHI Chalcone isomerase C4H Cinnamate 4­hydroxylase CHS Chalcone synthase 4CL 4­Coumarate CoA ligase cs Cộng sự CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide 2,4 D 2,4­Dichlorophenoxyacetic acid DFR Dihydroxyflavonol 4­ reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate FAP Fatty­acid­binding proteins F3H Flavanone­3­hydroxylase ELISA Enzyme­linked Xét nghiệm ELISA immunosorbentassay FLS Flavonol synthase FNS II Flavone synthase II GA3 Gibberellic acid Axit gibberellic GM Germination medium Môi trường nảy mầm GmCHI Glycine max chalcone isomerase IAA Idole acetic acid Axit idole acetic IBA Idolbutylic acid Axit idolbutylic IFS Isoflavone synthase ITS Internal transcribed spacers Kb Kilo base kDa Kilo Dalton 8 Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt LB Luria Bertani Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn LDOX Leucoanthocyanidin oxygenase L­Tyr L­tyrosine Axit amin L­tyrosine mRNA Messenger ribonucleic acid RNA thông tin MS Murashige và Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô thực vật NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic OD Optical density Mật độ quang Ori Origin Điểm khởi đầu sao chép PAL Phenylalanine ammonia­ lyase PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Ri­plasmid Root inducing­ plasmid RM Rooting medium Môi trường tạo rễ RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Rol Root locus Gen rol rpm Revolutions per minute Số vòng/ phút scFv Single­chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trường cảm ứng tạo chồi Taq DNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase T­DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào thực vật TDZ Thidiazuron Ti­plasmid Tumor inducing ­ plasmid Plasmid gây khối u T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi trong ống nghiệm T1 Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1 TL­DNA Transfer left ­DNA Vùng biên trái đoạn DNA 9 Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt được chuyển vào thực vật TR­DNA Transfer right ­DNA Vùng biên phải đoạn DNA được chuyển vào thực vật UV Ultraviolet Tia cực tím Vir Virus interferon resistance Gen vir vvm Volume volume minute Thể tích khí/thể tích chất lỏng/ phút WPM Woody plant medium Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy cây thân gỗ WT Wild type Cây không chuyển gen X­gal 5­bromo­4­chloro­3­indolyl­ β­D­galacto­pyranoside ZT Zeatin 10 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.

Sự sai khác về trình tự nucleotide của vùng ITS phân lập từ 5 mẫu Thổ nhân sâm so với T. paniculatum, mã số EU4103572 Bảng 3. Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ 5 mẫu Thổ nhân sâm so với T. paniculatum, mã số AY0152744 Bảng 3.

Ảnh hưởng của javel 60 % và HgCl2 0,1 % đến tỷ lệ nảy mầm của haṭ 8 Bảng 3. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ lá mầm70 Bảng 3. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên1 Bảng 3. Ảnh hưởng của tổ hợp 2 mg/l BAP và IBA đến sự phát sinh, sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên3 Bảng 3.

Ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ của cây Thổ nhân sâm4 Bảng 3. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Thổ nhân sâm5 Bảng 3. Hiệu quả tạo đa chồi từ lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên sau khi lây nhiễm A. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm9 Bảng 3.

Hàm lượng flavonoid tổng số của hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen T1­ 2.2; T1­ 10 và cây đối chứng không chuyển gen6 Bảng 3. Kết quả khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm 90 11 Bảng 3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ từ mô lá Thổ nhân sâm2 Bảng 3.

Xác định ngưỡng diệt khuẩn của cefotaxime sau 4 tuần3 Bảng 3. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng trưởng rễ tơ Thổ nhân sâm5 12 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2. Mẫu cây Thổ nhân sâm thu tại thành phố Thái Nguyên2 Hình 2. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301­GmCHI3 Hình 2.

Sơ đồ thí nghiệm tổng quát5 Hình 2. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm qua nách lá mầm3 13 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) là loại cây thân thảo được biết đến với giá trị dược liệu cao. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Thổ nhân sâm cho thấy, trong lá và rễ có rất nhiều các hợp chất có hoạt tính dược học khác nhau như: alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, phytosterol, phytol; trong đó các phytol chiếm tỷ lệ cao (69,32 %).

Từ lâu, Thổ nhân sâm đã được sử dụng trong y học cổ truyền, đặc biệt là trong điều trị bệnh tiểu đường type 2, viêm da, rối loạn tiêu hóa, yếu sinh lý và rối loạn sinh sản. Galactogue trong lá có tác dụng chống viêm, kích thích tăng tiết sữa ở phụ nữ cho con bú và có khả năng chữa bệnh viêm loét. Rễ của cây Thổ nhân sâm được sử dụng để thúc đẩy khả năng sinh sản và chữa các bệnh phụ khoa như bất thường trong chu kỳ kinh nguyệt. Steroid saponin trong rễ cây Thổ nhân sâm có tác dụng phòng và chữa bệnh xơ vỡ động mạch, đồng thời còn là nguyên liệu để tổng hợp nên hormone sinh dục.

Flavonoid là một hợp chất có vai trò quan trọng đối với con người như có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư… Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu về thu nhận flavonoid ở cây Thổ nhân sâm vì hàm lượng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum, trong đó có cây Thổ nhân sâm rất thấp. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để nâng cao hàm lượng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum nói chung và cây Thổ nhân sâm (T. paniculatum) nói riêng để có thể sử dụng trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Cho đến nay, đã có một số cách tiếp cận chủ yếu được áp dụng đối với cây dược liệu để làm tăng hàm lượng flavonoid.

Đó là sử dụng phương pháp chọn lọc từ quần thể hoặc lai hữu tính hay đột biến thực nghiệm, từ đó chọn lọc các dòng cây có hàm lượng flavonoid cao. Tuy nhiên, đối với cây Thổ nhân sâm chưa thấy công bố nào về ứng dụng phương pháp này để nâng cao hàm lượng flavonoid; nhưng việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật như chuyển gen và 14 nuôi cấy mô tế bào thực vật ở cây dược liệu đã được quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong thu nhận các dược chất, trong đó có flavonoid. Ở thực vật, flavonoid được tổng hợp qua đường phenylpropanoid, chuyển phenylalanine thành 4­coumaroyl­CoA và sau đó 4­coumaroyl­CoA sẽ đi vào quá trình tổng hợp flavonoid. Có rất nhiều các enzyme tham gia vào con đường tổng hợp flavonoid như phenylalanine ammonia­lyase, cinnamate 4­hydroxylase, 4­ Coumarate CoA ligase, chalcone synthase, chalcone isomerase… Trong đó, chalcone isomerase (CHI) là enzyme chìa khóa cho sinh tổng hợp flavonoid bằng việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở được đóng vòng để hình thành các naringenin.

Sau đó, hợp chất này sẽ được chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid chính như flavanone, flavonol và anthocyanin. Do vậy, biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme CHI sẽ làm tăng hoạt độ của enzyme chìa khóa CHI và hàm lượng các loại flavonoid trong cây chuyển gen sẽ được cải thiện. Ngoài ra, Thổ nhân sâm là loài cây có rễ củ, nhiều hợp chất thứ cấp được tập trung ở rễ, trong đó có flavonoid.