Luận án Biến đổi gen ty thể trong ung thư đại trực tràng - ĐHQGHN 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------------- T ị NG N Ứ NĐ Ủ T G NT T Ở N NG T Ư ĐẠ TRỰ TR NG LUẬN ÁN TI N Ĩ SINH HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------------------------- T ị NG N Ứ NĐ Ủ T G NT T Ở N NG T Ư ĐẠ TRỰ TR NG Chuyên ngành: Sinh ọ ờ ộ ậ Mã số: 62420104 LUẬN ÁN TI N Ĩ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Trịnh Hồng Thái 2. Tô Thanh Thúy Hà Nội - 2018 Ờ Đ N T i xin m o n yl ng tr nh nghi n ứu t i thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.Trịnh Hồng Thái v TS.T Th nh Thúy ũng như sự hỗ trợ, giúp ỡ củ á ồng nghiệp. á số liệu k t quả ủ lu n án l trung thự một phần k t quả ược công bố trên các tạp chí khoa học.

Việc sử dụng các dữ liệu trong lu n án củ t i ược sự chấp thu n bằng văn bản củ á ồng tác giả. Lu n án hư từng ược tác giả khác công bố. Nghiên cứu sinh Ph m Thị Bích LỜ N Lời ầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và bi t ơn s u sắ n PGS.Trịnh Hồng Thái và TS.Tô Thanh Thúy những người thầy/ lu n t n tình dìu dắt, hướng dẫn ộng viên khích lệ ịnh hướng và chỉ bảo cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện lu n án. T i xin h n th nh ám ơn á bá sĩ y tá Kho Giải phẫu bệnh – T bào, Bệnh viện K Hà Nội, Bệnh viện Quân Y 103, á bá sĩ y tá Kho S ng lọ máu Viện Huy t họ v Truy n máu Trung ương nhiệt t nh giúp ỡ, cung cấp mẫu nghi n ứu ũng như thông tin v i m bệnh họ ủ bệnh nhân UTĐTT húng t i thự hiện nghi n ứu n y.

Tôi xin chân thành cảm ơn to n th Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Sinh lý học và Sinh họ người, Khoa Sinh họ Trường Đại học Khoa học Tự nhi n truy n ạt cho tôi những ki n thức quý báu trong suốt thời gian học t p và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn n Ban giám hiệu Phòng S u ại họ Kho Sinh họ Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo i u kiện cho tôi hoàn thành các thủ tục bảo vệ. T i ũng xin h n th nh ảm ơn á ồng nghiệp và các bạn sinh viên Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng i m Công nghệ Enzyme v Protein Trường Đại học Khoa học Tự Nhi n lu n hỗ trợ giúp ỡ trong quá trình tôi làm thực nghiệm và sử lý số liệu k t quả. Lu n án ược thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí củ á tài KC.05 v tr ng th t bị ơ sở v t chất của phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng i m Công nghệ Enzyme và Pro- tein, Phòng thí nghiệm Sinh họ người thuộc Bộ môn Sinh lý học và Sinh họ người, Khoa Sinh họ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng bi t ơn tới gi nh v người th n lu n tạo i u kiện tốt nhất tôi hoàn thành lu n án. Phạm Thị Bích MỤC LỤC Ờ Đ N. ii MỤC LỤC. 5 DANH MỤC HÌNH.

T NG QUAN TÀI LI U. NG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG. Thực trạng mắ ung thư ại trực tràng. Các y u tố nguy ơ g y ung thư ại trự tr ng.

Một số i m bệnh học phản ánh ti n tri n củ ung thư ại trực tràng. Các chỉ thị sinh học củ ung thư ại trực tràng. H GEN TY TH VÀ HI N TƯỢNG DỊ T BÀO CHẤT. Hệ gen ty th và chứ năng.

Hiện tượng dị t bào chất v ngưỡng bi u hiện củ ột bi n ADN ty th. Đ T BI N ADN TY TH VÀ B N NG T Ư. Bi n ổi của một số gen ty th mã hóa cho các protein. Biến đổi trên gen ND1.

Biến đổi trên gen ND3. Một số biến đổi của gen COX-1 và COX-2 .Mất oạn lớn trên ADN ty th. Sự th y ổi số bản sao ADN ty th và bệnh ung thư. NG N Ứ NĐ Ủ ADN T T Ở TN.

Ư NG T N BI N Đ I GEN TY TH. Kỹ thu t PCR k t hợp với RFLP. Xá ịnh trình tự gen. á phương pháp ịnh lượng mứ ộ bi n ổi ADN ty th.

NG N Ư NG NG IÊN CỨU. Mẫu nghiên cứu. MÁY VÀ TRANG THI T BỊ. Ư NG NG N ỨU.

Tá h hi t ADN tổng số từ mẫu m ung thư ại trực tràng. Tách chi t ADN tổng số từ mẫu máu. Điện di trên gel agarose và gel polyacrylamide. Nhân bản oạn gen ty th chứ ột bi n quan tâm bằng kỹ thu t PCR.

Kỹ thu t P R v h nh hi u d i á oạn cắt giới hạn (PCR-RFLP). Nhân dòng trực ti p oạn gen chứ ột bi n vào vector pJET1. Giải tr nh tự á oạn gen hứ ột bi n. Tinh sạch sản phẩm PCR.

Định lượng mứ ộ mất oạn số bản s o ADN ty th. ẦN TN N Ọ Ư NG T NG ĐƯỢ Ử DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU. T QU VÀ TH O LUẬN. BI N Đ I CỦA CÁC GEN ND1, ND3, COX-1 VÀ COX-2 TY TH.

Bi n ổi T4216 v 4164G ủ gen ND1 ty thể. Biến đổi A4164G và một số biến đổi khác. Tần suất biến đổ 4 64 v ố n qu n v đặ đ ể n. Bi n ổi A10398G thuộc gen ND3 ty thể.

Một số vị tr bi n ổi ủ gen COX-1 và COX-2 ty th. MẤT Đ ẠN LỚN CỦA ADN TY TH Ở B N N ÂN NG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG. Xá ịnh mất oạn 4977 bp và một số mất oạn lớn khác. X định mất đoạn 4977 bp.

X định các mất đoạn l n khác 4977 bp. Mối liên quan giữ t lệ mất oạn 4977 bp với á i m bệnh học. Xá ịnh mứ ộ mất oạn lớn của ADN ty th ở bệnh nh n ung thư ại trực tràng bằng phương pháp re l-time PCR. X n đ n u n o kỹ thuật r -t P R địn độ ất đoạn n của ADN ty thể.

X định m độ mất đoạn trên các mẫu nghiên c u. Mối liên quan giữa mứ ộ mất oạn lớn với á i m bệnh học. SỰ T Đ I S B N SAO ADN TY TH Ở CÁC B NH NHÂN NG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG. Số bản sao ADN ty th ở các mẫu nghiên cứu.

Mối liên quan giữa số bản sao ADN ty th với á i m bệnh họ. T Đ NG T NG HỢP CỦA M T S BI N Đ I, MỨ Đ MẤT Đ ẠN, S B N SAO CỦA ADN TY TH VỚI TI N TRI N TĐTT. Đối với sự di ăn hạch. Đối với sự ti n tri n gi i oạn ung thư.

VAI TRÒ CỦA MẤT Đ ẠN, S B N SAO VỚ NG MẮ NG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG. Mối tương qu n v mứ ộ mất oạn, số bản sao ADN ty th giữa mẫu mô và mẫu máu, giữa mứ ộ mất oạn và số bản sao ADN ty th. Mứ ộ mất oạn tăng l m tăng nguy ơ mắ ung thư ại trực tràng. 88 BÀN LUẬN CHUNG.

100 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GI LIÊN QUAN Đ N LUẬN ÁN. Hệ thống ph n loại TNM ối với ung thư ại trự tr ng. Vị trí và chứ năng ủa các gen ty th. nh sá h i m bệnh họ v nồng ộ ADN tổng số từ á mẫu của bệnh nh n ung thư ại trự tr ng.

Ảnh iện di ADN tổng số từ một số mẫu nghiên cứu. Bản cam k t cho mẫu của bệnh nhân. Phi u lấy mẫu ung thư. So sánh trình tự oạn ADN của gen ND1, ND4, HBB với trình tự ADN ty th chuẩn, gen HBB bằng hương tr nh BL ST.

Một số bi n ổi, mất oạn 4977 bp, mứ ộ mất oạn, số bản sao ADN ty th củ m ung thư ại trự tr ng. K t quả real-time P R ồ thị củ h i ường chuẩn ND1 và ND4. Mứ ộ mất oạn số bản s o ADN ty th củ 40 bệnh nh n UTĐTT từ Bệnh viện Qu n Y 103. Dự oán khả năng mắ UTĐTT dựa vào mứ ộ mất oạn từ phân tích hồi quy ơn bi n.

Dự oán khả năng mắ UTĐTT dựa vào số bản sao ADN ty th và mất oạn từ phân tích hồi quy ơn bi n. Mối liên quan giữa mứ ộ mất oạn, số bản sao ADN ty th với á i m bệnh họ ủ bệnh UTĐTT. - 30 - 3 N Ụ Ữ VI T TẮT AJCC American Joint Committee on Cancer (hiệp hội ung thư Ho Kỳ) ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (c p b zơ) COX-1 Cytochrome c oxidase I COX-2 Cytochrome c oxidase II Cyt c Cytochrome c D-loop Displacement loop EtBr Ethidium bromide GĐ Gi i oạn HPLC High-performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng o) KSS Kearns-Sayre syndrome (hội chứng KSS) LHON Leber’s heredit ry opti neurop thy (hội chứng liệt thần kinh thị giác di truy n theo Leber) LCU Lân c n u MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes (hội chứng não gi t ơ tăng id l ti máu v giả tai bi n mạch) mtADN Mitochondrial ADN (ADN ty th ) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử) ND1 NADH dehydrogenase 1 ND3 NADH dehydrogenase 3 OXPHOS Oxidative phosphorylation (phosphoryl hóa oxy hóa) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) RFLP Restri tion fr gment length polymorphism ( h nh hi u dài các oạn cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (dạng oxy hoạt ộng) TNM Tumor- lymph Node- Metastases UTĐTT Ung thư ại trự tr ng Tm Melting temperature (nhiệt ộ nóng chảy) 4 N Ụ NG Bảng 1. Ph n hi gi i oạn UTĐTT ủa AJCC -2002.

Số lượng bệnh nh n UTĐTT theo i m bệnh học. á h hất h nh ượ sử dụng trong nghi n ứu. Tr nh tự á p mồi d ng trong nghi n ứu .