Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy Oleanolic acid của tế bào đinh lăng nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHAN THỊ Á KIM NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HUẾ - NĂM 2022 ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHAN THỊ Á KIM NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 942.01 HUẾ - NĂM 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Phòng đào tạo sau đại học, các Thầy Cô giáo Khoa Sinh, Bộ môn Công nghệ sinh học - Trƣờng đại học Khoa học Huế, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Quảng Nam. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý giá đó. Em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Lê Văn Tƣờng Huân, PGS.

TS Võ Thị Mai Hƣơng đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập; xin cảm ơn các anh chị công tác tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học Huế; Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu sắc đến GS. TS Nguyễn Hoàng Lộc – Ngƣời Thầy giáo mẫu mực, tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện luận án này. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những ngƣời thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập cho đến khi hoàn thành luận án này.

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Thừa Thiên Huế, tháng 4 năm 2022 Phan Thị Á Kim LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và nghiêm túc, tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả luận án MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

iv MỤC LỤC. i BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT. v DANH MỤC CÁC BẢNG. vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.

viii MỞ ĐẦU. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU.

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ.

Đặc điểm thực vật. Thành phần hóa học của cây đinh lăng lá nhỏ. Giá trị dƣợc lý của cây đinh lăng lá nhỏ. Cơ chế tác dụng của elicitor.

Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình k ch kháng. Nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp. Một số thành tựu trong sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật đƣợc xử lý elicitor. TỔNG QUAN VỀ OLEANOLIC ACID.

Vai trò và phân bố. Một số công dụng của oleanolic acid. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý. Sinh tổng hợp oleanolic acid.

Các nghiên cứu sản xuất oleanolic acid bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO VÀ SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP Ở CÂY ĐINH LĂNG. Nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ. Sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ.

Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ. Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU.

Đối tƣợng nghiên cứu. Nguyên liệu nghiên cứu. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Hóa chất và môi trƣờng nuôi cấy.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng của callus. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng của tế bào. Định lƣợng oleanolic acid. Xử lý thống kê.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA CALLUS. Ảnh hƣởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên sinh trƣởng của callus. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên sinh trƣởng của callus thân.

ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID CỦA TẾ BÀO. Nuôi cấy tế bào. Ảnh hƣởng của nguồn carbon. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng.

ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ. Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm men. Ảnh hƣởng của methyl jasmonate. ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY LÊN SINH TRƢỞNG CỦA CALLUS.

Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ. ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƢỞNG CỦA TẾ BÀO VÀ HÀM LƢỢNG OLEANOLIC ACID. Nuôi cấy tế bào huyền phù.

Ảnh hƣởng của nguồn carbon. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng. T ch lũy oleanolic acid trong tế bào. ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY OLEANOLIC ACID TRONG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ.

Đặc điểm của elicitor. Ảnh hƣởng của một số elicitor lên sinh trƣởng tế bào. Ảnh hƣởng của một số elicitor lên t ch lũy oleanolic acid. 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

92 iii KẾT LUẬN. 92 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 110 iv BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid BAP 6-benzyl aminopurine CAS Casamino acids Cs Cộng sự ĐC Đối chứng DW Dry weight (khối lƣợng khô) FW Fresh weight (khối lƣợng tƣơi) GI Growth index (Chỉ số sinh trƣởng) GPX Glutathione peroxidase GSH-px Gluthatione peroxidase HCTC Hợp chất thứ cấp HepG2 Human hepatocellular carcinoma (tế bào ung thƣ gan ở ngƣời) HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) IBA 3-indolebutyric acid IC50 Half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối đa một nữa) JA Jasmonic acid KIN Kinetin KTST Kích th ch sinh trƣởng MDA Malonaldehyde MeJA Methyl jasmonate MIC Minimum inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) MS Murashige and Skoog (1962) v MT Môi trƣờng NAA Naphthalene acetic acid OA Oleanolic acid PAA Phenyl acetic acid PGE2 Prostaglandin E2 ROS Reactive oxygen species SA Salicylic acid SOD Superoxide dismutase TB Tế bào TPA 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate TRYP Tryptone UA Ursolic acid YE Yeast extract (dịch chiết nấm men) vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

Phân loại elicitor trong sản xuất các hợp chất thứ cấp. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu. Ảnh hƣởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng sinh trƣởng của callus lá sau 5 tuần nuôi cấy. Ảnh hƣởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trƣởng của callus thân sau 5 tuần nuôi cấy.

Ảnh hƣởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trƣởng của callus rễ sau 5 tuần nuôi cấy. Ảnh hƣởng của TRYP lên khả năng sinh trƣởng của callus thân sau 5 tuần nuôi cấy. Ảnh hƣởng của CAS lên khả năng sinh trƣởng của callus thân sau 5 tuần nuôi cấy. Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên sự sinh trƣởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ.

Ảnh hƣởng của KIN và BAP kết hợp với 2,4-D lên khả năng sinh trƣởng của tế bào. Hàm lƣợng oleanolic acid trong các loại mẫu khác nhau. Ảnh hƣởng của YE lên sinh trƣởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ. Ảnh hƣởng của YE lên t ch lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá nhỏ.

Ảnh hƣởng của MeJA lên sinh trƣởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ. Ảnh hƣởng của MeJA lên t ch lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá nhỏ. 73 vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1. Cấu trúc hóa học của oleanolic acid.

Sinh tổng hợp cation dammarenyl (I), oleanyl, lupenyl và lupeol từ squalene. Sinh tổng hợp UA (4) và OA (5) từ cation oleanyl. Chu trình tổng hợp oleanolic acid ở thực vật. Cây đinh lăng lá nhỏ tự nhiên.

Callus có nguồn gốc từ lá sau 5 tuần nuôi cấy. Callus có nguồn gốc từ thân sau 5 tuần nuôi cấy. Callus có nguồn gốc từ rễ sau 5 tuần nuôi cấy. Callus lá sinh trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy.

Callus thân sinh trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung 1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy. Callus rễ sinh trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung 2 mg/L NAA và 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy. Callus thân sinh trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung 0,8 g/L TRYP sau 5 tuần nuôi cấy. Callus thân sinh trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung 0,4 g/L CAS sau 5 tuần nuôi cấy.

Đƣờng cong sinh trƣởng của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trƣờng cơ bản MS chứa 1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN. Sinh khối tƣơi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào đinh lăng lá nhỏ. Sắc ký đồ HPLC phân t ch hàm lƣợng oleanolic acid. Chất chuẩn oleanolic acid, B.

Tế bào trên môi trƣờng cơ bản MS chứa 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L 2,4-D, D. Tế bào trên môi trƣờng cơ bản MS chứa 1,25 mg/L KIN và 1 mg/L 2,4-D. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tƣơi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào đinh lăng lá nhỏ trong môi trƣờng cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 3 g/L lúc bắt đầu nuôi cấy. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tƣơi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trƣờng cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 1 g/L sau 6 ngày nuôi cấy.

Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tƣơi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trƣờng cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 10 µM lúc bắt đầu nuôi cấy. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tƣơi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trƣờng cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 100 µM sau 3 ngày nuôi cấy. 74 ix MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cùng với sự phát triển của nền y học, việc nghiên cứu chiết xuất các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để tạo ra những loại thuốc mới phục vụ sức khỏe con ngƣời ngày càng đƣợc quan tâm.