Nghiên cứu tổng hợp phức chất Puerarin-Maltose bằng enzyme & ứng dụng nước uống lên men

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN QUỐC BÌNH NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP PHỨC CHẤT PUERARIN - MALTOSE BẰNG ENZYME MALTOGENIC AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG LÊN MEN TỪ SẮN DÂY VÀ DỨA LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ NGÀNH: 62.01 NĂM 2021 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN QUỐC BÌNH MÃ SỐ NCS: P1115001 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP PHỨC CHẤT PUERARIN - MALTOSE BẰNG ENZYME MALTOGENIC AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG LÊN MEN TỪ SẮN DÂY VÀ DỨA LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ NGÀNH: 62.01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. LÝ NGUYỄN BÌNH TS. LÊ QUANG TRÍ NĂM 2021 luan an LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến PGS. Lý Nguyễn Bình và TS.

Lê Quang Trí. Sự hướng dẫn khoa học tận tình cùng với sự góp ý chân thành của quý thầy đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án này. Tôi cũng xin gởi lời tri ân đến quý Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ đã cung cấp cho tôi những kiến thức vô cùng quý báu. Đây chính là nền tảng kiến thức vững chắc giúp tôi có thể hoàn thành tốt luận án này nói riêng và công việc hiện tại nói chung.

Tôi cũng xin gởi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Tiền Giang đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Đặc biệt xin gởi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy, Cô Khoa Nông nghiệp và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Tiền Giang, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có những góp ý quý báu trong quá trình hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ và giúp đỡ tận tình của các cán bộ Trung tâm tư vấn và kiểm định chất lượng Nông lâm thủy sản, Chi cục Quản lý chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Tiền Giang đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện và phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu. Xin cảm ơn các anh, chị, bạn bè cùng các bạn nghiên cứu sinh cùng khóa Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ đã luôn động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin gởi lời biết ơn đến gia đình - chỗ dựa vững chắc để tôi có thể hoàn thành tốt việc học tập và nghiên cứu của mình. Chân thành cảm ơn. Cần Thơ, ngày …. tháng … năm 2021 Nghiên cứu sinh Trần Quốc Bình i luan an TÓM TẮT Hợp chất puerarin là một isoflavone có trong củ sắn dây rất tốt cho sức khỏe.

Tuy nhiên, thành phần puerarin tự nhiên này có độ tan trong nước thấp nên làm giảm tác dụng của tinh bột sắn dây. Để tăng độ tan của hợp chất này, enzyme Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA) được sử dụng để biến tính và tạo các dẫn xuất của puerarin tan tốt trong nước. Quá trình biến tính hợp chất puerarin được thực hiện qua hai bước dưới tác dụng lần lượt của enzyme β-amylase và BSMA. Ở mỗi bước, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và nồng độ enzyme lên hiệu quả biến tính được khảo sát.

Hiệu quả được đánh giá thông qua hàm lượng đường khử và hàm lượng puerarin tổng hợp được. Luận án bao gồm 3 nội dung chính: (i) Tối ưu hóa quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase thông qua các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme; (ii) Tối ưu hóa quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme BSMA thông qua các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme; (iii) Tối ưu hóa quá trình lên men nước dứa-sắn dây thông qua việc khảo sát ảnh hưởng của pH, Brix, tỷ lệ nấm men trong điều kiện lên men ở nhiệt độ thường. Nghiên cứu được bố trí thí nghiệm theo mô hình Box-Behnken và phương pháp bề mặt đáp ứng để tối ưu hóa các điều kiện của quá trình biến tính. Kết quả nghiên cứu cho thấy, bột sắn dây được thủy phân bằng enzyme β-amylase tốt nhất trong điều kiện tối ưu ở nhiệt độ 54,34°C, thời gian 4,24 giờ, nồng độ β-amylase 41,46 U/g bột có hàm lượng đường khử thu được là 161,07±2,96 mg/g.

Về ảnh hưởng của BSMA đến khả năng tổng hợp puerarin, kết quả cũng cho thấy điều kiện tối ưu cho cơ chất tinh bột sắn dây là 57,47°C; 4,05 giờ; BSMA 15,45 U/g bột. Dưới điều kiện tối ưu này, hàm lượng puerarin tổng hợp (khi phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp) là 7,51±0,02 mg/g. Trong bước tiếp theo, quá trình lên men nước dứa-sắn dây ở nhiệt độ thường đã được thử nghiệm và tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt kết hợp với thiết kế Box-Behnken với 3 yếu tố chính là pH, Brix và tỷ lệ nấm men. Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng mô hình đa thức bậc hai có thể được sử dụng để tối ưu hóa quá trình lên men để thu được hàm lượng puerarin cao nhất.

Puerarin được tối ưu hóa (7,4 mg/g) đã đạt đến hàm lượng dự đoán bởi mô hình tại các điều kiện pH 5,21; 22,12 Brix và tỷ lệ nấm men 11,16%, ngụ ý rằng mô hình phù hợp để dự đoán cho quá trình lên men với độ cồn thu được tương ứng là 6,02. Điểm trọng số trong đánh giá cảm quan được quy định bởi mức độ quan trọng của các yếu tố cấu thành màu sắc, mùi, và vị. Kết quả thống kê cho thấy rằng, với tỷ lệ phối trộn nước dứa và sắn dây 6:4, mẫu lên men đạt điểm cảm quan tổng là 17 điểm (lần lượt là 3,47±0,62; 5,07±0,70; 8,15±0,78 tương ứng cho màu sắc, mùi, và vị,). Khi tỷ lệ này được áp dụng cho quá trình lên men ở điều kiện pH 4,5, sản phẩm cuối đạt được mức điểm cảm quan cao nhất 16,09, tương đồng với sản phẩm thương mại.

Từ khóa: Bột sắn dây, BSMA, đường khử, puerarin, tối ưu hóa. ii luan an ABSTRACT Puerarin, the most abundant isoflavone in kudzu root, has been considered as a healthy compound. However, its natural form in kudzu possesses a low water solubility and thus lessens the kudzu flour’s function. To increase its solubility, the Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA) enzyme was used to modify puerarin and created soluble derivatives.

Modification of puerarin was carried out by 2 steps, treated with β-amylase and BSMA respectively. In each step, effects of substrate concentration, pH, hydrolysis temperature, hydrolysis time and enzyme concentration on the modification efficiency were investigated. The effectiveness was measured via reducing sugar content and synthesized puerarin content. The study includes three mainly part: (i) Optimization of hydrolysis of kudzu root starch using β-amylase with the reducing sugar content produced as a function of substrate concentration, pH, temperature, time and enzyme concentration.

(ii) Optimization of synthesized puerarin-maltose complex under the catalysis of BSMA enzyme through investigating the effects of pH, temperature, time and concentration of BSMA enzyme. (iii) Optimization of mixed pineapple juice puerarin-maltose fermentation through investigating the effects of pH, soluble content, yeast counts under the fermentation at ambient temperature. The Box-Behnken design and response surface methodology were applied to optimize the derivation of puerarin. The research results showed that the kudzu starch was hydrolyzed with the best β- amylase enzyme under optimal conditions at the temperature of 54.34°C, the time of 4.24 hr, the concentration of β-amylase 41.46 U/g powder with the content of reducing sugar obtained is 161.

On the effect of BSMA on the ability to synthesize puerarin, the optimal conditions were 57. The derived puerarin content analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was 7. In next step, the fermentation of mixed pineapple juice- kudzu juice under ambient temperature was conducted and optimized by response surface method combined with Box-Behnken design with 3 main factors: pH, Brix and yeast level. The results indicated that the quadratic polynomial model can be used to optimize the fermentation to obtain the highest level of puerarin.

The optimized puerarin (74 mg/g) reached the concentration predicted by the model at conditions pH 5.12 Brix and yeast ratio of 11.16%, implying that the model is suitable for prediction of the concentration of the fermentation process with the resulting alcohol content of 6. The weighting score in the sensory assessment is determined by the importance of the factors constituting color, odor, and taste. Statistical results show that, with the mixing ratio of pineapple juice and kudzu 6:4, the fermented samples achieved a total sensory score of 17 points (3.78 for color, odor, and taste, respectively). As this ratio was applied for a fermentation process at the pH level of 4.5, the fermented iii luan an product obtained the highest total sensorial score of 16.09, in accordance with commercial products.

Key words: BSMA, kudzu powder, optimization, puerarin, reducing sugar iv luan an LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày … tháng… năm 2021 Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án PGS. Lý Nguyễn Bình Trần Quốc Bình TS. Lê Quang Trí v luan an MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ.

iii LỜI CAM KẾT. vi DANH SÁCH BẢNG. ix DANH SÁCH HÌNH. xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.

xiv CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU. Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu chung. Mục tiêu cụ thể.

Nội dung nghiên cứu. Ý nghĩa nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn.

Tính mới của luận án .3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Nguyên liệu sắn dây. Nguồn gốc và nơi trồng. Một số loài chính của chi sắn dây.

Thành phần hóa học. Hợp chất puerarin. Nguyên liệu dứa.15 vi luan an 2. Thành phần hóa học.

Hệ enzyme amylase. Enzyme β-amylase (EC 3. Enzyme Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA). Quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose bằng enzyme maltogenic amylase.

Hoạt tính chuyển hóa của enzyme. Quá trình tổng hợp phức puerarin-maltose. Các ứng dụng hoạt tính chuyển hóa của enzyme. Nấm men trong lên men nước quả.

Cơ sở khoa học của quá trình lên men. Quá trình lên men. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước.

Tình hình nghiên cứu trong nước. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Các nghiên cứu có liên quan. Quá trình tách chiết isoflavones.

Hoạt tính chống oxy hóa.43 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương tiện nghiên cứu. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất.

Phương pháp nghiên cứu. Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc. Nội dung nghiên cứu. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.

Bố trí thí nghiệm .