Luận án tiến sĩ: Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên chuột của cây họ cà phê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHAN KIM ĐỊNH KHẢO SÁT HIỆU QUẢ KHÁNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ GAN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT CỦA MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ CÀ PHÊ (Rubiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 62420201 Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHAN KIM ĐỊNH Mã số NCS: P0915002 KHẢO SÁT HIỆU QUẢ KHÁNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ GAN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT CỦA MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ CÀ PHÊ (Rubiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 62420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGs. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG PGs. NGUYỄN TRỌNG TUÂN Năm 2021 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. Đái Thị Xuân Trang và PGS.

Nguyễn Trọng Tuân đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học, thực hiện luận án, viết báo hoàn thành chương trình đào tạo. Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến Thầy PGS. Nguyễn Văn Thành, PGS. Nguyễn Minh Chơn, TS.

Trương Thị Bích Vân và tập thể Thầy Cô Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học, Trường Đại học Cần Thơ đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành các hồ sơ, thủ tục suột thời gian học tập tại trường. Tôi xin cảm ơn tập thể Thầy Cô Bô môn Sinh học đã hỗ trợ phòng thí nghiệm và các thiết bị cần thiết trong thời gian thực hiện luận án. Đặc biệt, cảm ơn quý Thầy Cô đã chia sẻ công việc giành thời gian để tôi chuyên tâm học tập hoàn thành chương trình đào tạo. Tôi cũng xin cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn Hóa học đã hỗ trợ và chia sẻ thiết bị trong thời gian làm các thí nghiệm.

Cảm ơn Ban Chủ Nhiệm Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Trường Đại học Cần thơ đã tạo điều kiện và động viên tôi học tập hoàn thành chương trình đào tạo. Cảm ơn em Trần Chí Linh đã hỗ trợ tôi thực hiện các thí nghiệm. Cảm ơn các em sinh viên trong nhóm nghiên cứu đề tài liên quan đồng hành cùng tôi trong quá trình thực hiện luận án. Sau cùng tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình tôi, mọi người luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi chuyên tâm hoàn thành chương trình đào tạo.

Nghiên cứu sinh Phan Kim Định ii TÓM TẮT Họ Cà phê (Rubiaceae) là họ thực vật lớn, phân bố rộng rãi ở nhiều nơi đặc biệt là vùng Đồng bằng sông Cửu long. Thực vật họ Cà phê được biết có chứa một lượng lớn các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học như iridoid, anthraquinone, triterpene, phenolic và alkaloid. Nhiều loại cây thuộc họ Cà phê được sử dụng trong y học dân gian với tác dụng chữa các bệnh khác nhau. Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ gan của một số cây thuộc họ Cà phê.

Sử dụng phương pháp điều tra phỏng vấn người dân tại 3 địa điểm là các cơ sở y học cổ truyền thuộc 3 tỉnh Kiên Giang, An Giang và Vĩnh Long, để tìm hiểu thông tin về tình hình sử dụng cây thuốc trị các bệnh về gan trong dân gian. Qua đó làm cơ sở chọn mẫu thực vật để nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa, bảo vệ gan. Các cao chiết được định lượng sơ bộ hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng bằng các phương pháp đo quang phổ. Phương pháp loại bỏ gốc tự do 2, 2-diphenyl-1-picryl- hydrazyl, khả năng khử sắt, phosphomolypdenum được sử dụng các để đánh giá khả năng kháng oxy hoá của các cao chiết.

Phương pháp ức chế sự biến tính protein huyết thanh bò (BSA) được dùng để khảo sát hoạt tính kháng viêm. Carbon tetrachloride (CCl4) được sử dụng gây nhiễm độc gan trên chuột và silymarin được dùng như chất đối chứng dương trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan. Kết quả nghiên cứu đã thu thập được thông tin về tình hình sử dụng 50 cây thuốc điều trị bệnh gan thuộc 22 họ thực vật, trong đó họ Cà phê có số loài được sử dụng nhiều nhất. Các cây thuộc họ Cà phê bao gồm Trang to (lá, hoa), Mơ lông (lá), Mơ leo (lá), Gáo trắng (lá, vỏ thân, rễ), Gáo vàng (lá, vỏ thân, rễ), Lưỡi rắn (cả cây) và Lưỡi rắn trắng (cả cây) được chọn thu mẫu và chiết cao methanol (12 cao chiết methanol).

Qua khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng có 9 cao chiết được xác định có hàm lượng polyphenol, flavonoid, alkaloid tổng tương đối cao, cũng như có hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm. Các cao chiết gồm lá Trang to, lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng, rễ Gáo trắng, lá Gáo vàng, vỏ thân Gáo vàng, rễ Gáo vàng, lá Mơ lông và lá Mơ leo có hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm được chọn thử hoạt tính bảo vệ gan trên chuột. Kết quả có 6 cao chiết bao gồm lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng, rễ Gáo trắng, lá Gáo vàng, vỏ thân Gáo vàng, rễ Gáo vàng có khả năng làm giảm enzyme ALT, AST, điều hòa MDA và GSH trong gan tốt. Kết hợp với kết quả quan sát mô học gan chuột thí nghiệm, nghiên cứu đã chọn được cao chiết rễ Gáo vàng có hiệu quả bảo vệ gan tốt vừa có khả năng làm giảm enzyme ALT, AST, điều hòa hàm lượng MDA, GSH trong gan và bảo vệ được mô gan.

Thử nghiệm độc tính cấp cho thấy, các cao chiết lá Gáo vàng, vỏ thân Gáo vàng và rễ Gáo vàng có liều gây chết trên chuột lớn hơn 5000 mg/kg khối lượng chuột. Kết iii quả thử nghiệm độc tính bán trường diễn, sử dụng cao chiết rễ Gáo vàng ở liều 400 mg/kg khối lượng trong 90 ngày không thể hiện gây độc trên chuột. Cao methanol tổng rễ Gáo vàng được chiết phân đoạn lần lượt với dung môi n-hexan, ethyl acetate. Các phân đoạn được thử khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm, định lượng polyphenol, flavonoid, alkaloid tổng và thử hoạt tính bảo vệ gan.

Phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng được xác định có hoạt tính sinh học tốt nhất được chọn tiến hành phân lập chất. Kết quả nghiên cứu đã phân lập và xác định được 2 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetate gồm naucleficine và 3-O-rhamnoside quinovic acid. Từ khóa: AST, ALT, bảo vệ gan, CCl4, kháng oxy hóa, Rubiaceae. iv ABSTRACT The Rubiaceae family is a large plant family, widely distributed in many places, especially common in the Mekong Delta.

Rubiaceae species are known to contain large amounts of biologically active secondary compounds such as iridoids, anthraquinones, triterpenes, phenolics and alkaloids. Many plants of this family are used in folk medicine for the treatment of various diseases. The research was carried out to investigate the antioxidant and hepatoprotective activities of some plants of the Coffea family (Rubiaceae). The methods of surveying and interviewing people at 3 locations, which are traditional medicine centers in 3 provinces of Kien Giang, An Giang and Vinh Long, were used to find out information about the use of medicinal plants to treat liver diseases.

Thereby, this served as the basis for selecting plant samples to make methanol extracts to study antioxidant and hepatoprotective activities. The extracts were preliminarily quantified of total polyphenols, flavonoids and alkaloids contents by spectrophotometric methods. The 2, 2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl free radical scavenging, reducing power, and phosphomolybdenum methods were used to evaluate the antioxidant capacity of the extracts. Bovine serum protein (BSA) denaturation inhibition test was used to investigate anti-inflammatory activity.

Carbon tetrachloride (CCl4) was used to induce hepatotoxicity in mice and silymarin was used as a positive control in screening test hepatoprotective activity. The research have investigated the use of 50 medicinal plants to treat liver disease belonging to 22 plant families, in which the Coffea family has the most widely used species. The seven plant species of the Rubiaceae family include Ixora duffii (leaves, flowers), Paederia lanuginosa Wall (leaves), Paederia scandens L. (leaves), Neolamarckia cadamba (Roxb.) Bosser (leaves, stem bark, roots), Nauclea orientalis L.

(whole plant) and Hedyotis diffusa Willd. In the investigation of antioxidant and anti-inflammatory activity, the quantification of total polyphenol, flavonoid and alkaloid content, 9 extracts were determined to have relatively high content of polyphenols, flavonoids, total alkaloids, as well as antioxidant and anti-inflammatory activities. The extracts including Ixora duffii leaves extract, Neolamarckia cadamba (Roxb.) Bosser leaves, stem bark and root extracts, Nauclea orientalis L. leaves, stem bark root extracts, Paederia scandens L.

leaves extract and Paederia lanuginosa Wall. leaves extract with antioxidant and anti-inflammatory activities were selected for studying on hepatoprotective activity in mice. As a result, there were 6 extracts including Neolamarckia cadamba (Roxb.) Bosser leaves, stem bark and root extracts, Nauclea orientalis L. leaves, stem bark and root extracts which have the ability to reduce ALT, v AST enzymes, modulate MDA and GSH contents in the liver.

Combined with the results of histological observations of the liver of experimental mice, the study has selected the extract of Nauclea orientalis L. root with good hepatoprotective effect with both of the ability to reduce ALT, AST enzymes, regulate MDA and GSH levels in the liver, and protect liver tissue. Acute toxicity test results showed that lethal dose in 50 percent of Nauclea orientalis L. leaves, stem bark and root extracts in mice was greater than 5000 mg/kg body weight.

The sub-chronic toxicity test results of mice treated with Nauclea orientalis L. roots extract at dose of 400 mg/kg body weight in 90 days, also did not show toxicity in mice. The Nauclea orientalis L. roots methanol extract was fractionated with sequential n-hexane, ethyl acetate sovents.

Fractions were tested for antioxidant, anti-inflammatory activities, total polyphenols, flavonoids, alkaloids contents, and hepatoprotective activity. The ethyl acetate fraction displayed the highest activities was selected to isolate compounds. Research results have isolated and identified two compounds from the ethyl acetate fraction consisting of naucleficine and 3-O-rhamnoside quinovic acid. Keywords: antioxidant, ALT, AST, CCl4, hepatoprotective activity, Rubiaceae.

vi LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. Đái Thị Xuân Trang và PGS. Nguyễn Trọng Tuân. Các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 Người hướng dẫn 1 Nghiên cứu sinh PGS. Đái Thị Xuân Trang Phan Kim Định Người hướng dẫn 2 PGS. Nguyễn Trọng Tuân vii MỤC LỤC Mục lục .vii Danh sách bảng. x Danh sách hình .xii Danh mục từ viết tắt.

xiii Chương 1: Giới thiệu. 1 Chương 2: Tổng quan tài liệu .1 Tổng quan về các dạng oxy hoạt động và chất kháng oxy hóa .1 Các dạng oxy hoạt động .2 Chất kháng oxy hóa .3 Một số phương pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa .2 Tổng quan về gan .1 Sơ lược cấu trúc và chức năng gan .2 Các thông số chức năng gan .3 Đặc điểm mô học của gan .3 Nguyên nhân gây tổn thương gan .1 Các chất gây độc gan .2 Stress oxy hóa ảnh hưởng đến chức năng gan .4 Các dạng tổn thương gan .