Luận án tiến sĩ phát triển sinh khối NPV trên tế bào sâu khoang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THANH HẢI HÀ PH¸T TRIÓN SINH KhèI Virus NH¢N §A DIÖN (NPV) TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT THUèC TRõ S¢U SINH HäC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THANH HẢI HÀ PH¸T TRIÓN SINH KhèI VIrus NH¢N §A DIÖN (NPV) TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT THUèC TRõ S¢U SINH HäC Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. Hoàng Đình Hoà PGS. Lê Văn Trịnh Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án này là trung thực, không trùng lặp với các đề tài luận án nào khác và chưa được tác giả khác công bố. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả i LỜI CẢM ƠN Qua một thời gian nỗ lực học tập và nghiên cứu, tới nay tôi đã hoàn thành luận án tiến sĩ: “Phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học”.

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự dạy bảo tận tình của các thầy cô, đồng thời cũng nhận được sự giúp đỡ và động viên của các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội và Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu đề tài luận án này. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy GS. Hoàng Đình Hoà và PGS.TS Lê Văn Trịnh đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi và về lòng say mê nghiên cứu khoa học.

Tôi xin chân thành cảm ơn các chị em anh đồng nghiệp của Trung tâm Đấu tranh Sinh học – Viện Bảo vệ thực vật, cùng các đồng nghiệp nơi tôi công tác và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài luận án tốt nghiệp này. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu nặng tới những người thân trong gia đình đã động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả ii MỤC LỤC Diễn giải Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1 2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài 3 3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4 5. Những đóng góp mới của luận án 4 CHƯƠNG 1. CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu 5 1.

Tổng quan tài liệu 6 1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 6 1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng 6 1. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại 8 1.

Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng 12 1. Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng 18 1. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 28 1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV 32 1.

Tình hình nghiên cứu ở trong nước 35 1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng 35 1. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại 36 1. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng 37 1.

Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV 38 1. Nghiên cứu tạo dạng và sử dụng chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại 41 iii CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Vật liệu, hoá chất và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 43 2.

Vật liệu nghiên cứu 43 2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 43 2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 44 2. Địa điểm nghiên cứu 44 2.

Thời gian nghiên cứu 44 2. Nội dung nghiên cứu 44 2. Phương pháp nghiên cứu 44 2. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang 44 2.

Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân 49 2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang 50 2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi 55 2. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 61 2.

Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào 61 2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 62 2. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 62 2. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu 66 CHƯƠNG 3.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên sâu khoang 67 3. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của virus nhân đa diện (NPV) ngoài đồng ruộng 67 3. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao 71 3.

Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 78 3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 79 3. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 79 3. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm 89 iv 3.

Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân 93 3. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV) 94 3. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) 103 3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế bào và trên sâu 105 3.

Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào 108 3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm nước 110 3. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang 110 3. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước 115 3.

Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 118 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm 118 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới 119 3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng 121 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.

Đề nghị 129 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Diễn giải chữ viết tắt ADN Axit Deroxyribo Nucleic CT Công thức CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) FBS Fetal Bovin Serum (Huyết thanh) et al. Những người khác LSD Mức sai khác có ý nghĩa MOI Multiplicity of Infection (Chỉ số lây nhiễm) cs. Cộng sự NSNN Ngày sau nuôi nhân NSLN Ngày sau lây nhiễm NPV Nuclear Polyhedrosis Virus (Virus nhân đa diện) OB Occlusion Bodies (Thể vùi) PBS Photphatse Buffer Saline PIB Polyhedral shaped inclusion Bodies (Thể vùi nhân đa diện) QCVN Qui chuẩn Việt Nam QG.NPV Quĩ gen virus nhân đa diện TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam SDS Sodium Dodecyl Sulfate TB Trung bình vi DANH MỤC BẢNG Diễn giải Trang Bảng 3. Mật độ sâu khoang phát sinh và tỷ lệ sâu chết do NPV trên các cây trồng ngoài đồng ruộng (2014- 2015) 69 Bảng 3.

Mức độ phổ biến của NPV ký sinh sâu khoang trên các cây trồng ngoài đồng ruộng (2014- 2105) 70 Bảng 3. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang ở các ngày sau lây nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 1 73 Bảng 3. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang sau 7 ngày lây nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 2 75 Bảng 3. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang sau 7 ngày lây nhiễm của các chủng NPV điển hình sau phân lập lần thứ 4 76 Bảng 3.

Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang sau 7 ngày lây nhiễm của các chủng NPV đã được lựa chọn 77 Bảng 3. Mật độ tế bào sâu khoang ở các ngày sau nuôi nhân trên các môi trường khác nhau 80 Bảng 3. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau 82 Bảng 3. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức pH môi trường khác nhau 84 Bảng 3.

Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân trên môi trường có bổ sung huyết thanh FBS với tỷ lệ khác nhau 86 Bảng 3. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân in vitro ở điều kiện thích hợp 87 Bảng 3. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình lọc khuẩn 250ml 90 Bảng 3. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân với lượng 750ml môi trường trên bình lọc khuẩn 1000ml theo phương pháp tĩnh và lắc 92 Bảng 3.

Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào có mật độ khác nhau 95 vii Bảng 3. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào theo chỉ số MOI khác nhau 96 Bảng 3. Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ lây nhiễm NPV khác nhau 98 Bảng 3. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang với các loại môi trường khác nhau 99 Bảng 3.

Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang ở nhiệt độ khác nhau 100 Bảng 3. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang ở các mức pH môi trường khác nhau 102 Bảng 3. Mật độ tế bào sâu khoang và số thể vùi hình thành sau các ngày lây nhiễm NPV theo chỉ số MOI khác nhau 105 Bảng 3. Hiệu lực trừ sâu khoang của các nguồn NPV được tạo ra từ lây nhiễm trên tế bào và trên sâu khoang 106 Bảng 3.

Số lượng thể vùi hình thành từ các nguồn NPV tạo ra từ lây nhiễm trên tế bào và trên sâu khoang 107 Bảng 3. Hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh khối trên tế bào và trên sâu khoang 109 Bảng 3. Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi sau tinh sạch theo các phương pháp khác nhau 112 Bảng 3. Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ 114 Bảng 3.