Luận án phD: Nghiên cứu đặc điểm gen PPV ở lợn miền Trung Việt Nam

ĐẠI HỌC HUẾ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN TRẦN TRUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN MÃ HÓA PROTEIN CẤU TRÚC CỦA VIRUS PARVO TRÊN LỢN (PORCINE PARVOVIRUS-PPV) Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN TRUNG VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HUẾ - 2024 ĐẠI HỌC HUẾ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN TRẦN TRUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN MÃ HÓA PROTEIN CẤU TRÚC CỦA VIRUS PARVO TRÊN LỢN (PORCINE PARVOVIRUS-PPV) Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN TRUNG VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC MÃ SỐ: 9420101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TRẦN QUỐC DUNG TS. NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY HUẾ, 2024 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong Luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được sử dụng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Huế, ngày 01 tháng 8 năm 2023 Tác giả luận án Nguyễn Trần Trung i LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Quý Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế cùng Quý cán bộ Phòng Khoa học, Đào tạo và Hợp tác quốc tế, Bộ môn Sinh học và Công nghệ sinh học ứng dụng, Phòng Tổ chức hành chính Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã hướng dẫn tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Viện. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến: PGS. Trần Quốc Dung - Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế và TS. Nguyễn Thị Diệu Thúy - Phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS. Trương Thị Hồng Hải, TS. Nguyễn Thị Kim Cúc, TS. Nguyễn Quang Cơ cùng quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập tại cơ sở đào tạo.

Tôi xin chân thành cám ơn: - Quý cán bộ, nhân viên Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế - Quý cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Sự hỗ trợ kinh phí thực nghiệm từ đề tài Nafosted mã số 106-NN.62 - Sự tài trợ từ Học bổng đào tạo Tiến sĩ năm 2021 và 2022 của Quỹ VINIF. Cuối cùng, tôi xin kính dâng lòng biết ơn của tôi lên hai đấng sinh thành: Ba Nguyễn Trần Đường và Mẹ Nguyễn Thị Minh Thuỳ. Xin cám ơn tất cả sự chia sẻ, động viên và hỗ trợ dành cho tôi từ những người thân trong gia đình, em trai Nguyễn Trần Thịnh và tất cả quý thiện hữu tri thức. Xin chân thành cám ơn! Huế, ngày 01 tháng 8 năm 2023 Tác giả luận án Nguyễn Trần Trung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT-TIẾNG VIỆT. viii DANH MỤC BẢNG. xi DANH MỤC HÌNH ẢNH.

xiii MỞ ĐẦU. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU. Mục tiêu tổng quát.

Mục tiêu cụ thể. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. Thu mẫu, tách chiết DNA tổng số. Phân lập và sàng lọc các chủng PPV.

Khuếch đại và xác định trình tự nucleotide gen mã hóa protein cấu trúc của PPV. Phân tích, đánh giá biến đổi trình tự nucleotide và amino acid dự đoán từ gen mã hóa protein cấu trúc và xây dựng cây phát sinh chủng loại các chủng PPV. PHẠM VI NGHIÊN CỨU. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. HIỆN TRẠNG CHĂN NUÔI VÀ DỊCH BỆNH TRÊN LỢN Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG VIỆT NAM. GIỚI THIỆU VỀ PPV VÀ BỆNH DO PPV Ở LỢN.

Phân loại PPV. Đặc điểm sinh học của PPV. Dịch tễ học PPV. Tương tác giữa virus và tế bào.

Cơ chế gây bệnh. Triệu chứng bệnh do PPV. Phòng ngừa PPV. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PPV TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM.

Tình hình nghiên cứu PPV trên thế giới. Sự lưu hành PPV. Biến đổi di truyền ở gen mã hóa protein cấu trúc. Tiến hóa của PPV.

Phát hiện các chủng PPV khác. Tình hình nghiên cứu PPV ở Việt Nam. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. Mẫu nghiên cứu. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Mồi phát hiện các chủng PPV.

Mồi khuếch đại gen mã hóa protein cấu trúc PPV. Trình tự các chủng PPV nghiên cứu. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp thu thập mẫu.

Phương pháp tách chiết DNA. Quy trình tách chiết DNA từ máu chống đông. Quy trình tách chiết DNA từ mô phổi. Phương pháp điện di.

Phương pháp thiết kế mồi và PCR. Phương pháp giải trình tự gen. Phương pháp xử lý và phân tích trình tự gen. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại.

Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. PHÁT HIỆN PPV1, PPV2, PPV3 VÀ PPV4 LƯU HÀNH TRÊN LỢN Ở BẢY TỈNH MIỀN TRUNG. Phát hiện PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4 ở bảy tỉnh miền Trung.

Kết quả phát hiện PPV1. Kết quả phát hiện PPV2. Kết quả phát hiện PPV3. Kết quả phát hiện PPV4.

Tỷ lệ phát hiện PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4 ở bảy tỉnh miền Trung. Tỷ lệ phát hiện PPV1. Tỷ lệ phát hiện PPV2. Tỷ lệ phát hiện PPV3.

Tỷ lệ phát hiện PPV4. Tỷ lệ đồng nhiễm các chủng PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4. Tỷ lệ đồng nhiễm hai chủng PPV. Tỷ lệ đồng nhiễm ba chủng PPV.

Tỷ lệ đồng nhiễm bốn chủng PPV. TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN CẤU TRÚC CÁC CHỦNG PPV TRÊN LỢN Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG. Trình tự gen mã hóa protein cấu trúc của các chủng PPV2. Trình tự hệ gen của các chủng PPV4.

Trình tự hệ gen của các chủng PPV4 phân lập ở miền Trung Việt Nam. Trình tự gen VP của các chủng PPV4 phân lập ở miền Trung Việt Nam. Trình tự khung đọc mở ORF3 của các chủng PPV4 phân lập ở miền Trung Việt Nam. Trình tự vùng gen NS1/VP1 của các chủng PPV3.

ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN MÃ HÓA PROTEIN CẤU TRÚC CỦA PPV PHÂN LẬP Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG. Đặc điểm phân tử gen mã hóa protein cấu trúc các chủng PPV2 phân lập ở các tỉnh miền Trung. Đặc điểm trình tự nucleotide gen VP của PPV2. Đặc điểm trình tự amino acid dự đoán từ gen VP của PPV2.

Mức độ tương đồng nucleotide/amino acid dự đoán từ gen VP của PPV2 99 3. Mối quan hệ di truyền các chủng PPV2 dựa vào gen VP. Đặc điểm phân tử hệ gen, gen mã hóa protein cấu trúc và ORF3 của các chủng PPV4 phân lập ở các tỉnh miền Trung. Đặc điểm phân tử hệ gen PPV4.

Đặc điểm phân tử gen VP của PPV4. Đặc điểm phân tử ORF3 của PPV4. Mức độ tương đồng nucleotide/amino acid của các chủng PPV4 phân lập tại miền Trung Việt Nam. Mối quan hệ di truyền các chủng PPV4.

Đặc điểm phân tử vùng gen NS1/VP1 của các chủng PPV3 phân lập ở vi các tỉnh miền Trung. 123 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 131 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

134 PHỤ LỤC vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT-TIẾNG VIỆT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt bp base pair cặp bazơ nitơ CP Capsid protein Protein capsid CPE Cytopathogenic effect Hiệu ứng bệnh tích tế bào cs et al. cộng sự DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic EDTA Ethylene diamine tetraacetic Axit etylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme Linked Xét nghiệm miễn dịch hấp thụ Immunosorbent Assay liên kết với enzyme FAO Food and Agriculture Tổ chức Lương thực và Nông Organization of the United nghiệp Liên hiệp quốc Nations FMD Foot-and-mouth disease Bệnh Lở mồm long móng HA Haemagglutination test Xét nghiệm đông máu HI Haemagglutination inhibition Xét nghiệm ức chế đông máu test ICTV International Committee on Ủy ban Quốc tế về phân loại Taxonomy of Viruses virus kb kilobase ki-lô-bazơ MDCF Modified direct complement- Xét nghiệm cố định bổ thể trực fixation (test) tiếp viii NCBI National Center for Trung tâm Thông tin Công nghệ Biotechnology Information sinh học Quốc gia (Mỹ) NS Non-structural protein Protein không cấu trúc ORF Open Reading Frame Khung đọc mở PBS Phosphate-buffered saline Dung dịch muối đệm photphat PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PCVAD Porcine Circovirus Associated Bệnh liên quan đến virus PCV ở Diseases lợn PDNS Porcine dermatitis and Hội chứng bệnh thận ở lợn nephropathy syndrome PhoV Porcine Hokovirus Virus Hoko lợn PK15 Pig Kidney 15 Dòng tế bào thận lợn 15 PMWS Postweaning Multisystemic Hội chứng còi cọc sau cai sữa ở Wasting Syndrome lợn PPV Porcine parvovirus Virus parvo lợn PPV1 Porcine parvovirus 1 Virus parvo lợn 1 PPV2 Porcine parvovirus 2 Virus parvo lợn 2 PPV3 Porcine parvovirus 3 Virus parvo lợn 3 PPV4 Porcine parvovirus 4 Virus parvo lợn 4 PPV5 Porcine parvovirus 5 Virus parvo lợn 5 PPV6 Porcine parvovirus 6 Virus parvo lợn 6 PPV7 Porcine parvovirus 7 Virus parvo lợn 7 PPV8 Porcine parvovirus 8 Virus parvo lợn 8 PRDC Porcine Respiratory Disease Hội chứng suy hô hấp ở lợn Complex PRRS Porcine reproductive and Hội chứng hô hấp và sinh sản ở respiratory syndrome lợn ix RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic ROS Reactive oxygen species Gốc tự do SATp Small alternatively translated Protein nhỏ được dịch mã thay protein thế SLC Steroidogenic luteal cells Tế bào thể vàng SMEDI Stillbirth Mummification Hội chứng suy giảm khả năng Embryonic Death and sinh sản ở lợn Infertility SN Serum neutralization (test) Xét nghiệm trung hoà huyết thanh ssDNA single-stranded DNA ADN sợi đơn ST Swine testicular cells Tế bào tinh hoàn lợn TE Tris EDTA Đệm TE TBE Tris, borate and EDTA Đệm TBE VLP Virus-like particle Hạt giống virus VP Viral coat and capsid protein Protein vỏ capsid của virus x DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Kích thước hệ gen và gen VP của các chủng PPV1, PPV2, PPV3 và PPV4. Tỷ lệ lưu hành của PPV trên thế giới.

Các vị trí khác biệt trong trình tự amino acid VP2 giữa các chủng châu Âu và châu Á (Oh và cs, 2017). Phân loại các chủng PPV lưu hành trên thế giới. Thông tin về các mẫu nghiên cứu được thu thập .