Luận án TS: Tăng cường chống chịu Melia azedarach L. bằng công nghệ gen thực vật

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI VĂN THẮNG NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU CÁC ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÂY XOAN TA (Melia azedarach L.) BẰNG CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2014 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI VĂN THẮNG NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU CÁC ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÂY XOAN TA (Melia azedarach L.) BẰNG CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Chu Hoàng Hà 2. Lê Văn Sơn Hà Nội, 2014 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Biến đổi khí hậu ngày càng diễn ra mạnh mẽ là nguyên nhân làm tăng những bất lợi từ môi trƣờng, ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nhiều loài cây trồng.

Do sự thay đổi khí quyển với hiệu ứng nhà kính, nhiệt độ của khí quyển ấm dần lên, băng tan ở hai cực sẽ tạo sự ngập lụt ở các vùng đất thấp. Lũ lụt, hạn hán và sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề lớn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến phát triển nông lâm nghiệp. Để thích ứng với những biến đổi khí hậu và những hệ quả của chúng, chiến lƣợc chung của ngành nông lâm nghiệp là ƣu tiên tạo ra những giống cây trồng chống chịu đƣợc khô hạn, mặn, ngập úng, lạnh và chống chịu với đất có vấn đề nhƣ acid, thiếu lân, ngộ độc sắt, ngộ độc nhôm. Những tác động bất lợi từ môi trƣờng nhƣ khô hạn, đất nhiễm mặn, ngập úng, nhiệt độ cực đoan thƣờng làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của nhiều loài cây trồng (Linhui et al.

Một trong những phản ứng thƣờng gặp nhất khi cây gặp các điều kiện bất lợi về nƣớc đó là tăng cƣờng tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa nhƣ các loại đƣờng tan, axít amin, v. để tăng cƣờng áp suất thẩm thấu cho tế bào. Proline và glycine betaine đƣợc biết đến là một trong những chất đóng vài trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, mặn, lạnh (Sávio et al. Trong tế bào thực vật, glycine betaine (GB) đƣợc tổng hợp từ choline thông qua hai phản ứng liên tiếp đƣợc xúc tác bởi choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al.

Cũng giống nhƣ thực vật bậc cao, ở vi khuẩn E. coli và ở một số động vật, con đƣờng sinh tổng hợp GB cũng trải qua hai bƣớc là khử choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine aldehyde thành GB (Takabe et al. Ngƣợc lại, con đƣờng sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens lại rất đơn giản, từ choline chuyển hóa thành sản phẩm trực tiếp là GB chỉ cần xúc tác bởi choline oxydase (COD) (Ikuta et al. Sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể đƣợc thực hiện qua hai con đƣờng hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine.

Con đƣờng sinh tổng hợp proline từ glutamate đƣợc chứng minh đầu tiên ở vi khuẩn bởi Leisinger (Leisinger, 1987) và sau đó là ở nhiều loài sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn 2 khác nhau. Ở thực vật bậc cao, chu trình này chỉ đƣợc xác định sau khi các nhà khoa học thành công trong việc phân lập đƣợc đoạn cDNA của gen mã hóa cho enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) (Hu et al. P5CS là một enzyme giữ hai chức năng, thứ nhất enzyme hoạt hóa glutamate trở thành dạng hoạt động là glutamic semialdehyde và sau đó xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra pyrroline-5-carboxylate. Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi enzyme pyrroline-5-carboxylate reductase để tạo proline.

Từ những hiểu biết sâu sắc về con đƣờng sinh tổng hợp glycine betaine và proline ở sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây trồng biến đổi gen. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc các gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GB và proline. Các gen này đã đƣợc thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng (Amudha & Balasubramani, 2011). Các kết quả công bố cho thấ y : Cây Arabidopsis thaliana chuyể n gen codA,COX, GSMT/SDMT tăng cƣờng khả năng chiụ la ̣nh , nhiê ̣t đô ̣ cao, chịu mă ̣n và băng giá (Ali et al., 1998a, 1998b; Hayashi et al., 1997, 1998; Sakamoto et al., 2000; Huang et al., 2000), cây cải be ̣ (Brassica juncea) chuyể n gen codA có khả năng chiụ mă ̣n tố t hơn cây đố i chƣ́ng (Waditee et al.

Tƣơng tự, cây lúa (Oriza sativa) chuyển gen codA, betA,COX, CMO, cây cà chua, cây hồng, cây bạch đàn chuyể n gen codA cũng tăng cƣờng kh ả năng chiụ la ̣nh , hạn, mă ̣n và oxy hóa (Sakamoto et al., 1998, Takabe et al., 1998; Su et al., 2006; Shirasawa et al., 2006; Mohanty et al., 2002; Park et al., 2004, 2007a; Yu et al. Cây thuốc lá chuyển gen COX, betA, CMO, BADH (Lilius et al., 1996; Nuccio et al., 1998; Yang et al., 2008), cây cà rốt chuyển gen BADH (Kumar et al., 2004); cây bông và ngô chuyển gen betA (Lv et al., 2007; Quan et al., 2004a, 2004b) cũng đã đƣợc chứng minh là chống chịu tốt hơn với các điều kiện cực đoan của môi trƣờng. Kết quả nghiên cứu chuyển gen P5CS, P5CR,  -OAT tham gia sinh tổng hợp proline vào cây thuốc lá, lúa nƣớc, lúa mì, cà rốt, chanh, đậu tƣơng, Arabidopsis cho thấy cây chuyển gen chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trƣờng sống bị mặn, hạn, oxy hóa, nhiệt cao và băng giá (Kavi Kishor et al., 1995; Zhu et al., 1998; Hong et al., 3 2000; Anoop et al., 2003; Su & Wu, 2004; Sawahel & Hassan, 2002; Han & Hwang, 2003; Hur et al., 2004; Molinari et al., 2004; De Ronde et al. Việt Nam là một trong những quốc gia bị tác động mạnh mẽ của việc biến đổi khí hậu, do đó hạn hán và đất nhiễm mặn hoang hóa đang ngày một gia tăng, đây sẽ là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lƣợng cây trồng nông lâm nghiệp và thu hẹp diện tích đất canh tác.

Vì vậy, viê ̣c triể n khai các nghiên cƣ́u nhằ m ta ̣o ra đƣơ ̣c các giố ng cây trồ ng nông lâm nghiệp có khả năng chố ng chiụ đƣơ ̣c các điề u kiê ̣n bấ t lơ ̣i của môi trƣờng nhƣng vẫn đảm bảo đƣơ ̣c năng suấ t và chấ t lƣơ ̣ng tố t đang là vấ n đề cấ p bách và cầ n thiế t nhấ t hiê ̣n nay. Trên thế giới, các nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi chủ yếu tập chung vào nhóm cây nông nghiệp, còn nhóm cây lâm nghiệp (cây gỗ) mới chỉ có một vài công trình công bố (Yu et al., 2009, Yu et al. Trong lâm nghiệp, cây dƣơng (Populus sp.) đƣợc sử dụng nhƣ là cây mô hình cho các nghiên cứu chuyển gen. Tuy nhiên, hạn chế duy nhất của loài cây này đó là khó sinh trƣởng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam.

Vì vậy, việc tìm kiếm một loài cây dễ thích ứng và phổ biến ở Việt Nam để làm cây mô hình cho các nghiên cứu theo hƣớng quan tâm trên đối tƣợng cây lâm nghiệp trở nên rất cần thiết. Cây Xoan ta đƣợc đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta. Nó có mặt ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó 3 vùng: Vùng Trung tâm, vùng Đồng bằng Sông Hồng và vùng Nam Trung bộ Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển theo quyết định số 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 của Bộ trƣởng Bộ NN&PTNT. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu trong việc xây dựng phƣơng pháp chuyển gen ở đối tƣợng cây Xoan ta là rất có triển vọng (Bui Van Thang et al., 2007a; Nirsatmanto & Gyokusen, 2007; Ngo Van Thanh et al., 2010) cho phép các nhà khoa học có thể tiến hành các nghiên cứu cải thiện giống, đặc biệt là nâng cao tính chống chịu của loài cây này và có thể sử dụng nhƣ một loài cây mô hình cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp ở Việt Nam.

Xuấ t phát tƣ̀ nhƣ̃ng lý do nêu trên, chúng tôi đã tiế n hành thƣ̣c hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu tăng cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trên đối tƣợng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật”. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2. Mục tiêu chung: Thông qua công nghệ chuyển gen để nghiên cứu khả năng tăng cƣờng tính chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi trên đối tƣợng cây Xoan ta nhằm bổ sung thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc tạo giống cây trồng lâm nghiệp có khả năng chống chịu tốt với điều kiện môi trƣờng bất lợi. Mục tiêu cụ thể: (1) Xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta đạt hiệu suất cao để làm công cụ nghiên cứu; (2) Đánh giá đƣợc hoạt động của promoter rd29A cảm ứng hạn ở các dòng Xoan ta chuyển gen; (3) Đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn của các dòng Xoan ta chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngƣợc (P5CSm); (4) Đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn, mặn của các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển gen codA.

Nội dung nghiên cứu (1) Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta thông qua Agrobacterium tumefaciens; (2) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A::gus intron và đánh giá hoạt động của promoter rd29A điều khiển biểu hiện gen gus trong điều kiện bình thƣờng và xử lý hạn nhân tạo; (3) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A:: P5CSm và đánh giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn nhân tạo; 5 (4) Tạo các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen 35S::TP- codA/35S::codA và đánh giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn, mặn nhân tạo.