Luận án TS: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu endochitinase từ B. thuringiensis - Trịnh Thị Thu Hà

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2018 1 2 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. Ngô Đình Bính Viện Công nghệ sinh học 2. Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2018 2 i LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. Ngô Đình Bính, giáo viên hướng dẫn khoa học, người đã tạo điều kiện và luôn ở bên truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cám ơn người hướng dẫn khoa học - PGS. Đồng Văn Quyền - Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học cùng các cán bộ thuộc Trung tâm đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin cám ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện làm việc thuận lơi nhất cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này.

Tôi xin cám ơn Bộ phận đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài Viện Công nghệ sinh học đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong gia đình, những người luôn bên tôi động viện, chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày……tháng….năm 2018 Tác giả Trịnh Thị Thu Hà ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án. Hà Nội, ngày ….năm 2018 Tác giả Trịnh Thị Thu Hà iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………. 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1. Vi khu n Bacillus thuringiensis………………………………… 5 1.

S phát tri n và ng ng c chitin s t. thuringi nsis tr n th gi i 7 1. Cấu trúc c chitin s …………………………………………………. C ch ho t ộng c chitin s ……………………………………….

Các y u t nh h ng n ho t t nh c chitin s …………………. Các y u t nh h ng n quá tr nh sinh t ng h p chitin s. Hệ i u hiện Esch richi co i. Một s y u t nh h ng n quá tr nh n m n t ng h p chitin s tái t h p………………………………………………………………… 29 1.

Thu h i và tinh s ch chitin s tái t h p……………………………. Ứng d ng c a chitinase. Trong nông nghiệp và o vệ môi tr ng. Ứng d ng trong công nghiệp.

Ứng d ng trong y c. Ứng d ng trong c tính sinh kh i nấm. Ứng d ng trong công nghệ sinh học. Sơ lƣ c về tình hình sâu bệnh hại cây trồng…………………….

36 iv Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2. Vật liệu nghiên cứu. Ch ng gi ng và p smi ………………………………………………… 39 2. Môi tr ng nuôi cấy……………………………………………………… 40 2.

Phƣơng pháp nghiên cứu. Ph ng pháp vi sinh. Ph ng pháp hó sinh. Ph ng pháp sinh học phân tử.

T i u i u kiện i u hiện th o ph ng pháp mặt áp ng. Nghiên c u tính chất hóa lý c a chitinase tái t h p. Ph ng pháp thử nghiệm. 57 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3.

Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……………………………………………… 58 3. Ph n p vi khu n. Phân lo i i loài các ch ng B. Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng.

thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………. Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 65 3. Sàng ọc ho t t nh kháng nấm c các ch ng.

thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 66 3. Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var. Th i gian nuôi cấy……………………………………………………… 67 3. Nhiệt ộ nuôi cấy……………………………………………………….

pH môi tr ng nuôi cấy………………………………………………. Môi tr ng thay th ……………………………………………………. Nhân d ng gen chiA mã h a chitinase từ ch ng vi khu n B.4 Biểu hiện gen chiA trong vi khu n E. Thi t k vector bi u hiện gen chiA trong vi khu n E.

Bi u hiện chiA tái t h p trong E. Nghiên c u i u kiện bi u hiện gen chiA c a ch ng tái t h p……. T i u kh năng i u hiện rChi ằng ph ng pháp mặt áp ng………………………………………………………………………. Ki m tra s t ng th ch giữa mô hình và th c nghiệm.

Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p……………. Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 90 3. Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt………………………………………… 90 3. pH t i u và ộ b n pH………………………………………………….

Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 92 3. Ảnh h ng c a chất t y rử ……………………………………………. Ảnh h ng c a dung môi hữu c ………………………………………. Động học c a ph n ng nzym ……………………………………….

S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitin s ……………………. Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p……………………… 95 3. Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p…. Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p…….

97 Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 99 4. Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……………………………………………. Ph n p vi khu n. Phân lo i i loài kurstaki các ch ng B.

Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki…………………………………………………………. Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki……………………………………………………….

Sàng lọc ho t tính kháng nấm c các ch ng. thuringi nsis serovar kurst ki………………………………………………………. Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var. Th i gi n nuôi cấy……………………………………………………….

Nhiệt ộ nuôi cấy………………………………………………………… 103 4. pH môi tr ng nuôi cấy…………………………………………………. Môi tr ng thay th ……………………………………………………. Phân tích trình t gen chiA và cấu trúc mô phỏng c a protein ChiA ……………………………….

Biểu hiện rChiA trong vi khu n E. Bi u hiện rChiA trong vi khu n………………………………………… 108 4. T i u i u kiện bi u hiện………………………………………………. T i u kh năng i u hiện rChiA bằng ph ng pháp mặt áp ng……………………………………………………………………… 112 vii 4.

Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………… 113 4. Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 114 4. Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt………………………………………… 114 4. pH t i u và ộ b n pH………………………………………………… 115 4.

Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 115 4. Ảnh h ng c chất t y rử. Ảnh h ng c a dung môi hữu c. Động học c a ph n ng enzym.

S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitinase. Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p. Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p. Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p.

119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 122 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 123 TÓM TẮT KẾT QUẢ LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH. 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO……….

130 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ch viết tắt Ch viết ầy Bp Base pair BSA Bovine serum albumin – albumin huyết thanh bò BT Chế phẩm Bacillus thuringiensis Bt Bacillus thuringiensis Btk Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Colloidal chitin Chitin dạng keo cs Cộng sự chiA Gen mã hóa chitinase ĐC Đối chứng dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribo Nucleotide 5‟- Triphosphate DNS 3,5 - dinitrosalicylic E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid EtBr Ethidium Bromide g/l Gam/lít GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)2 Diacetyl-chitobiose (GlcNAc)3 Triacetyl-chitotriose (GlcNAc)4 Tetraacetyl-chitotetraose IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside – chất cảm ứng Kana Kanamycine kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria –Bertani – môi trường nuôi cấy vi khuẩn MTCS Môi trường cơ sở OD Optical density - mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi ix PDA Môi trường khoai tây rChiA Chitinase tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulphate Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium SDS-PAGE doecyl sulfat Sol Solution – dung dịch TAE Tris acetic acid EDTA TE Tris EDTA U Unit - đơn vị v/p Vòng/phút X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside x DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Thành phần các môi trường nuôi cấy………………………… 40 Bảng 2. Thành phần và nồng độ các loại dung dịch………………….

Kết quả phân lập và kết quả xác định hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập………………………………………… 60 Bảng 3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh………………… 62 Bảng 3. Hoạt tính thủy phân chitin của các chủng Btk………………. Hoạt tính kháng nấm của các chủng sinh chitinase………….

Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino acid………. Sinh trưởng của tế bào và hoạt tính enzym ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau……………………………………………….