Luận án tiến sĩ sinh học: Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen - La Việt Hồng
Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua nhằm ứng dụng sinh học phân tử trong nông nghiệp.
Năm xuất bản
Số trang
145
Thời gian đọc
22 phút
Lượt xem
1
Lượt tải
0
Phí lưu trữ
40 Point
Tổng quan nhanh
- Chủ đề:
- 1. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong thực vật
- Số trang:
- 145 trang
- Trường:
- Viện Công nghệ sinh học
- Chuyên ngành:
- Công nghệ sinh học
- Tác giả:
- La Việt Hồng
- Năm:
- 2015
Tóm tắt nội dung luận án
I. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong thực vật
Nhu cầu về chất làm ngọt tự nhiên không sinh calo ngày càng tăng cao trong xã hội hiện đại. Canh tác phân tử (plant molecular farming) mở ra hướng đi đột phá cho việc sản xuất protein quy mô lớn. Thực vật cung cấp nền tảng biểu hiện an toàn sinh học cao và chi phí thấp. Hệ thống này có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã chuẩn xác. Quá trình biểu hiện dị nguồn trong thực vật giúp giải quyết hạn chế về nguồn cung từ tự nhiên. Nghiên cứu tập trung vào việc tạo ra protein miraculin tái tổ hợp chất lượng cao. Các cây ký chủ họ Cà đóng vai trò nhà máy sinh học tiềm năng. Toàn bộ quy trình hướng tới mục tiêu tối ưu hóa hiệu suất thu nhận protein chức năng.
1.1. Tiềm năng tạo vị từ quả cây thần kỳ Synsepalum dulcificum
Miraculin là một glycoprotein đặc biệt được chiết xuất từ quả cây thần kỳ (Synsepalum dulcificum). Hợp chất này có tính chất biến đổi vị giác độc đáo. Protein liên kết chặt chẽ với thụ thể vị ngọt trên lưỡi người. Khi gặp môi trường axit, cấu trúc protein thay đổi và kích hoạt tín hiệu vị ngọt mạnh mẽ. Nguồn cung quả tự nhiên rất khan hiếm do cây sinh trưởng chậm. Cây thần kỳ chỉ thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới đặc thù. Khả năng bảo quản quả tươi sau thu hoạch gặp nhiều khó khăn. Việc sản xuất protein miraculin tái tổ hợp qua công nghệ sinh học là giải pháp tất yếu. Phương pháp này đáp ứng nhu cầu sử dụng cho người bệnh tiểu đường và người ăn kiêng.
1.2. Canh tác phân tử plant molecular farming sản xuất protein
Canh tác phân tử (plant molecular farming) sử dụng thực vật như những lò phản ứng sinh học tự nhiên. Hệ thống thực vật sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội so với tế bào vi khuẩn hoặc động vật. Thực vật không chứa mầm bệnh nguy hiểm lây truyền sang người. Chi phí thiết lập và mở rộng quy mô sản xuất trong nông nghiệp tương đối thấp. Cây trồng có bộ máy tế bào hoàn chỉnh để gấp cuộn protein phức tạp. Các chuỗi đường được gắn kết chính xác đảm bảo hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp. Phương pháp này giảm thiểu rủi ro tạp nhiễm nội độc tố vi khuẩn. Nghiên cứu tận dụng tiềm năng này để biểu hiện miraculin hiệu suất cao.
1.3. Cơ sở sinh học của biểu hiện dị nguồn trong thực vật họ Cà
Họ Cà (Solanaceae) bao gồm nhiều đối tượng mô hình và cây trồng nông nghiệp phổ biến. Biểu hiện dị nguồn trong thực vật họ Cà mang lại hiệu suất sinh khối lớn. Các tế bào thực vật nhận diện tốt các tín hiệu điều hòa di truyền tái tổ hợp. Tốc độ phân chia tế bào nhanh giúp rút ngắn chu kỳ nghiên cứu và thu nhận sản phẩm. Khả năng tiếp nhận gen ngoại lai của cây họ Cà diễn ra rất thuận lợi. Quá trình tái sinh cây in vitro đạt tỷ lệ thành công cao và đồng đều. Cây mô hình cung cấp nền tảng vững chắc để thử nghiệm các cấu trúc biểu hiện gen khác nhau. Đây là tiền đề quan trọng để tối ưu hóa sản lượng protein mục tiêu.
II. Tối ưu mã di truyền và thiết kế vector gen miraculin
Hiệu suất biểu hiện gen dị nguồn phụ thuộc lớn vào mức độ tương thích codon của vật chủ. Sự khác biệt về tần suất sử dụng codon có thể cản trở quá trình dịch mã mRNA. Nghiên cứu thực hiện tối ưu hóa cấu trúc gen miraculin dựa trên bảng mã di truyền cây họ Cà. Các cấu trúc vector nhị thể mang gen chuyển được thiết kế và lắp ráp chuẩn xác. Sự kết hợp giữa các trình tự promoter và terminator chuyên biệt giúp tăng cường phiên mã. Hệ thống plasmid tái tổ hợp được kiểm tra độ ổn định trước khi đưa vào thực vật. Toàn bộ thiết kế vector nhằm đảm bảo tính biểu hiện mạnh mẽ và bền vững của protein mục tiêu.
2.1. Thay đổi mã codon tương thích hệ thực vật Solanaceae
Trình tự gen mã hóa miraculin tự nhiên có nhiều codon hiếm gặp ở cây họ Cà. Tần suất xuất hiện codon không phù hợp làm suy giảm tốc độ dịch mã của ribosome. Tối ưu hóa mã di truyền giúp thay thế các codon hiếm bằng các codon phổ biến nhất. Hàm lượng GC trong chuỗi nucleotide được điều chỉnh về mức cân bằng sinh học lý tưởng. Các cấu trúc bậc hai bất lợi trên phân tử mRNA được loại bỏ hoàn toàn. Các vị trí đa adenyl hóa sớm và tín hiệu kết thúc phiên mã giả bị triệt tiêu. Gen tổng hợp nhân tạo đạt độ tương thích tối đa với bộ máy dịch mã của ký chủ. Kết quả này tạo điều kiện nâng cao đáng kể lượng protein tổng hợp.
2.2. Lựa chọn promoter E8 và CaMV 35S điều khiển phiên mã
Promoter đóng vai trò quyết định đến mức độ và vị trí biểu hiện của gen chuyển. Nghiên cứu sử dụng promoter cấu trúc CaMV 35S để kích hoạt phiên mã liên tục ở mọi mô. Promoter CaMV 35S cho hiệu quả biểu hiện mạnh trong lá và dòng tế bào nuôi cấy. Đối với quả cà chua, promoter đặc hiệu quả E8 được đưa vào thử nghiệm. Promoter E8 chỉ hoạt động mạnh khi quả bước vào giai đoạn chín sinh lý. Sự tích lũy protein miraculin tái tổ hợp được định vị chủ yếu tại thịt quả. Cách tiếp cận này hạn chế ảnh hưởng tiêu cực của protein dị nguồn đến sự sinh trưởng sinh dưỡng. Vector chuyển gen được hoàn thiện với các tổ hợp promoter phù hợp.
2.3. Cấu trúc terminator HSP 18 nâng cao độ bền vững mRNA
Trình tự kết thúc phiên mã terminator ảnh hưởng trực tiếp đến độ ổn định của bản phiên mã. Terminator HSP 18.2 phân lập từ thực vật được đưa vào cấu trúc vector chuyển gen. Đoạn trình tự này thay thế hiệu quả cho terminator NOS thông thường. Terminator HSP 18.2 hỗ trợ quá trình gắn đuôi poly-A diễn ra hoàn chỉnh và chính xác. Phân tử mRNA sau phiên mã có tuổi thọ cao hơn trong tế bào chất. Tốc độ thoái hóa của mRNA mục tiêu giảm đi rõ rệt. Nhờ đó, lượng khuôn mẫu cho quá trình dịch mã tăng lên đáng kể. Cấu trúc cải tiến này góp phần tối đa hóa lượng protein miraculin tích lũy.
III. Biểu hiện gen miraculin trong hệ thống nuôi cấy thuốc lá
Hệ thống thực vật thuốc lá là công cụ kinh điển để thử nghiệm biểu hiện protein dị nguồn. Thuốc lá cung cấp sinh khối lớn cùng thời gian sinh trưởng ngắn. Nghiên cứu tiến hành đánh giá biểu hiện miraculin trên nhiều mô hình tế bào và mô thực vật. Dòng tế bào Nicotiana tabacum BY2 và mô rễ tơ được sử dụng làm đối tượng chính. Hệ thống biểu hiện tạm thời (transient expression) trên lá Nicotiana benthamiana cũng được triển khai đồng thời. Quy trình chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens đạt hiệu quả biến nạp cao. Kết quả phân tích khẳng định sự hiện diện và hoạt động của protein mục tiêu.
3.1. Chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens vào tế bào BY2
Chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens là phương pháp hiệu quả để đưa vector vào tế bào thực vật. Chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc pBI121 được đồng nuôi cấy với dòng tế bào BY2. Tế bào Nicotiana tabacum BY2 duy trì trạng thái huyền phù với tốc độ phân chia cực nhanh. Các cụm tế bào chuyển gen được chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh thích hợp. Quá trình chọn lọc diễn ra nghiêm ngặt để thu được dòng tế bào ổn định. Sự xâm nhập và gắn xen của T-DNA vào hệ gen tế bào được kiểm chứng rõ ràng. Dòng tế bào BY2 chuyển gen sinh trưởng tốt và tích lũy đều đặn protein miraculin tái tổ hợp.
3.2. Đánh giá biểu hiện tạm thời transient expression lá thuốc lá
Biểu hiện tạm thời (transient expression) trên cây Nicotiana benthamiana cho phép thu nhận protein nhanh chóng. Kỹ thuật tiêm huyền phù vi khuẩn Agrobacterium vào mô lá được thực hiện chuẩn xác. Phương pháp này chỉ mất vài ngày để kiểm tra hoạt động của cấu trúc gen mới. Mức độ phiên mã của gen miraculin đạt đỉnh sau ba đến năm ngày sau tiêm. Protein mục tiêu được tổng hợp với số lượng lớn trong các tế bào trung bì lá. Kỹ thuật Western blot và ELISA xác nhận sự có mặt của chuỗi polypeptide miraculin đúng kích thước. Phương pháp biểu hiện tạm thời giúp sàng lọc nhanh các vector trước khi tiến hành chuyển gen bền vững.
3.3. Tích lũy protein tái tổ hợp trong hệ thống rễ tơ thực vật
Hệ thống rễ tơ được tạo ra thông qua sự lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Rễ tơ thuốc lá sinh trưởng nhanh chóng trên môi trường lỏng không chứa chất kích thích sinh trưởng. Cấu trúc mô rễ có tính ổn định di truyền rất cao qua nhiều thế hệ nuôi cấy. Rễ tơ liên tục tổng hợp và giải phóng protein vào môi trường nuôi cấy xung quanh. Quá trình tinh sạch protein từ môi trường dịch thể diễn ra thuận lợi hơn mô lá. Hàm lượng protein miraculin tái tổ hợp duy trì ổn định trong suốt chu kỳ nuôi cấy. Đây là hệ thống sản xuất khép kín đầy hứa hẹn cho các protein giá trị cao.
IV. Chuyển gen bền vững tạo protein miraculin trong cà chua
Cà chua (Solanum lycopersicum) là đối tượng lý tưởng cho mục đích sản xuất protein ăn được qua đường miệng. Quả cà chua có thể sử dụng trực tiếp mà không cần qua quy trình tinh sạch phức tạp. Nghiên cứu thực hiện chuyển gen bền vững (stable transformation) vào các giống cà chua phổ biến. Mô sẹo tái sinh và phát triển thành cây hoàn chỉnh dưới điều kiện chọn lọc nghiêm ngặt. Các cây chuyển gen sinh trưởng bình thường, ra hoa và kết trái ổn định. Sự biểu hiện của gen miraculin được kiểm soát chặt chẽ ở giai đoạn quả chín. Nghiên cứu mở ra triển vọng tạo nguồn thực phẩm chức năng tự nhiên mang vị ngọt an toàn.
4.1. Biến nạp chuyển gen bền vững stable transformation cà chua
Quy trình chuyển gen bền vững (stable transformation) được tiến hành trên mô tử diệp cây Solanum lycopersicum. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chuyển đoạn T-DNA mang gen miraculin vào nhân tế bào thực vật. Các đoạn mô lá mầm sau biến nạp được nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi đặc thù. Quá trình tạo rễ và chọn lọc trên kháng sinh kanamycin diễn ra đồng bộ. Cây cà chua chuyển gen thế hệ T0 được thuần hóa thành công trong nhà lưới. Các cá thể chuyển gen phát triển khỏe mạnh và cho quả đồng đều. Tỷ lệ phân ly của gen chuyển ở các thế hệ sau tuân theo đúng quy luật di truyền Mendel.
4.2. Kiểm tra PCR và Southern blot xác định số bản sao gen đích
Kỹ thuật PCR được ứng dụng để kiểm tra nhanh sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua. Phản ứng khuếch đại cho thấy băng đặc hiệu đúng kích thước phân tử dự kiến. Phân tích RT-PCR xác nhận quá trình phiên mã mRNA diễn ra mạnh mẽ trong tế bào thực vật. Kỹ thuật lai Southern blot giúp xác định chính xác số lượng bản sao gen chuyển gắn vào hệ gen. Các dòng mang một bản sao duy nhất được ưu tiên lựa chọn để nghiên cứu tiếp theo. Dòng chuyển gen một bản sao đảm bảo tính ổn định di truyền cao và tránh hiện tượng tắt gen. Kết quả phân tích phân tử khẳng định sự gắn xen thành công của cấu trúc tái tổ hợp.
4.3. Đánh giá mức độ tích lũy protein miraculin trong quả chín
Quả cà chua chuyển gen ở các giai đoạn phát triển khác nhau được thu thập để định lượng protein. Khi quả còn xanh, hàm lượng miraculin tích lũy ở mức rất thấp hoặc không đáng kể. Khi quả chuyển sang giai đoạn chín đỏ, promoter E8 kích hoạt phiên mã mạnh mẽ. Lượng protein miraculin tái tổ hợp tăng vọt và đạt nồng độ cực đại trong mô quả chín. Phân tích SDS-PAGE và Western blot cho thấy protein tồn tại dưới dạng dimer có hoạt tính. Protein miraculin được glycosyl hóa đầy đủ tương tự protein tự nhiên từ cây thần kỳ. Quả cà chua chín biến thành nguồn dự trữ protein tạo vị ngọt giàu giá trị dinh dưỡng.
V. Đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng của miraculin
Protein miraculin tái tổ hợp thu nhận từ thực vật cần được kiểm chứng hoạt tính cảm quan. Nghiên cứu đánh giá khả năng tương tác của protein với các thụ thể vị giác trong môi trường axit. Quả cà chua và dịch chiết rễ tơ được sử dụng trong các thử nghiệm cảm quan tiêu chuẩn. Protein tái tổ hợp giữ nguyên cấu trúc không gian ba chiều và liên kết disulfide quan trọng. Khả năng biến đổi vị chua thành vị ngọt được ghi nhận rõ rệt và kéo dài. Sản phẩm mở ra cơ hội ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và y dược học. Đây là giải pháp đột phá giúp hỗ trợ người có chế độ ăn kiêng nghiêm ngặt.
5.1. Khả năng làm biến đổi vị chua thành vị ngọt tự nhiên
Protein miraculin tái tổ hợp thể hiện cơ chế hoạt động tương đương protein tự nhiên từ cây thần kỳ (Synsepalum dulcificum). Khi tiếp xúc với niêm mạc lưỡi, protein bám dính vào thụ thể tiếp nhận vị ngọt. Trong điều kiện pH trung tính, protein không gây ra bất kỳ cảm giác ngọt nào. Khi dung dịch có tính axit đi vào khoang miệng, các gốc acid amin của miraculin bị proton hóa. Sự thay đổi cấu hình không gian kích hoạt mạnh mẽ thụ thể cảm nhận vị ngọt. Vị chua của axit lập tức chuyển đổi thành cảm giác ngọt thanh tự nhiên. Hiệu ứng làm ngọt duy trì liên tục trong vòng một đến hai giờ mà không để lại dư vị lạ.
5.2. Triển vọng canh tác phân tử quy mô lớn phục vụ sức khỏe
Thành công trong việc biểu hiện miraculin trên Solanum lycopersicum và Nicotiana tabacum mang ý nghĩa thực tiễn lớn. Canh tác phân tử (plant molecular farming) cung cấp nguồn nguyên liệu sạch với chi phí vận hành hợp lý. Quả cà chua chuyển gen có thể chế biến thành các sản phẩm bột dinh dưỡng hoặc dùng tươi. Người mắc bệnh đái tháo đường và người béo phì có thể thưởng thức vị ngọt mà không nạp calo. Công nghệ chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens tạo nền tảng vững chắc để mở rộng sản xuất quy mô công nghiệp. Nghiên cứu góp phần thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp vào chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Mục lục chi tiết luận án
Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung
Tải đầy đủ (145 trang)Trích đoạn nội dung luận án
Tải xuống để đọc toàn bội Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Chu Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các cán bộ Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận quản lý đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Khoa học Công nghệ trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Phạm Bích Ngọc-Phòng Công nghệ tế bào thực vật, PGS. Lê Văn Sơn-Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành đề tài này. Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng.
Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, các bạn đồng nghiệp, những ngƣời đã luôn động viên và góp ý cho tôi trong thời gian qua. Hà Nội, tháng 6 năm 2015 Nghiên cứu sinh La Việt Hồng ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, một phần đã công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 19 tháng 6 năm 2015 Tác giả La Việt Hồng iii Mục lục Lời cảm ơn.
i Lời cam đoan. ii DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC HÌNH. vii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT.
ix MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.
Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn. Ý nghĩa thực tiễn. Đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN. Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin. TĂNG CƢỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT.
Lựa chọn hệ thống biểu hiện. Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã). Ảnh hƣởng terminator đến sự biểu hiện của gen chuyển. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện.
NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ VÀ CÂY CÀ CHUA. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2). Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật. Cây cà chua chuyển gen.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu thực vật. Vector và chủng vi khuẩn. Hóa chất và thiết bị máy móc.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở cây họ cà. Thiết kế mồi.
Phân lập promoter và terminator. Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin. Phƣơng pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen.
Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Phân tích sự biểu hiện gen trong các dòng chuyển gen. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.
THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ. PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ TERMINATOR HSP 18. Thay đổi mã di truyền của gen miraculin phù hợp với hệ biểu hiện ở cây họ cà. Phân lập và tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter và terminator HSP 18.
THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter.
Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter. Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2.
Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong rễ tơ thuốc lá. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY CÀ CHUA. Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng kỹ thuật PCR.
Phân tích sự biểu hiện ở mức mRNA của gen miraculin trong một số dòng cà chua chuyển gen. Xác định số bản copy trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật Southern. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trƣởng của một số dòng cà chua chuyển gen. Tăng cƣờng sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong thực vật.
Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua chuyển gen .99 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .104 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .108 TÀI LIỆU THAM KHẢO .112 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Một số đặc tính của protein ngọt và tạo cảm giác ngọt 4 Bảng 1. So sánh ƣu nhƣợc điểm giữa các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp 14 Bảng 2.
Trình tự nucleotide của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 2. Thành phần phản ứng lai ghép tạo vector tái tổ hợp 37 Bảng 3. So sánh trình tự promoter E8 phân lập với trình tự promoter E8 đã công bố 53 Bảng 3. So sánh trình tự nucleotide của promoter HSP 18.2 phân lập đƣợc với các trình tự gen/promoter HSP 18.2 đã công bố 56 Bảng 3.
Kết quả tạo và chọn lọc các dòng tế bào BY2 mang gen chuyển miraculin 66 Bảng 3. Khối lƣợng tƣơi và khối lƣợng khô của một số dòng tế bào BY2 chuyển gen 69 Bảng 3. Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen miraculin 72 Bảng 3. Khối lƣợng tƣơi và khối lƣợng khô của một số dòng rễ tơ chuyển gen 75 Bảng 3.
Chỉ tiêu chiều dài của một số dòng rễ tơ chuyển gen 76 Bảng 3. Kết quả tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin 81 Bảng 3. Một số chỉ tiêu sinh trƣởng và hình thái của năm dòng cà chua chuyển gen 87 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) và quả cắt dọc 7 Hình 1.
Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy trong phần thịt quả cây thần kỳ 8 Hình 1. Mô hình cấu trúc 3D của protein miraculin dạng homodimer 9 Hình 1. Mô hình thụ thể T1R2+T1R3 liên kết với protein cảm giác ngọt 10 Hình 2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32 Hình 3.
Trình tự gen miraculin trƣớc (AB512278.1) và sau khi thay đổi mã di truyền 50 Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng promoter E8 52 Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng promoter HSP 18. Hình ảnh điện di sản phẩm phân lập và nhân dòng terminator HSP 18.
Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 58 Hình 3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter 59 Hình 3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/35S/Mir/HSP-ter 61 Hình 3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 62 Hình 3.
Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter 63 Hình 3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 63 Hình 3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter 64 Hình 3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt vector chuyển gen thu từ Agrobacterium 65 Hình 3.
Quá trình tạo dòng tế bào thuốc lá BY2 mang gen miraculin 67 Hình 3. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng BY2 bằng kỹ thuật PCR 68 viii Hình 3. Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculin trong một số dòng tế bào BY2 chuyển gen 70 Hình 3. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng BY2 chuyển gen 71 Hình 3.
Quá trình tạo và chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin 73 Hình 3. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng rễ tơ bằng kỹ thuật PCR 74 Hình 3. Hình ảnh chiều dài của một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen. Hình ảnh phân tích sự biểu hiện của protein miraculintrong một số dòng rễ tơ 78 Hình 3.
Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp trong một số dòng rễ tơ chuyển gen 79 Hình 3. Quá trình tạo và sàng lọc cà chua chuyển gen miraculin 82 Hình 3. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng kỹ thuật PCR 83 Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR kiểm tra sự biểu hiện mRNA của gen chuyển miraculin trong các dòng cà chua 84 Hình 3.
Hình ảnh xác định số bản copy trong các dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật Southern Blot 86 Hình 3. Hình ảnh dòng cà chua chuyển gen ngoài tự nhiên 88 Hình 3. Quả cà chua giai đoạn chín đỏ 89 Hình 3. Hàm lƣợng miraculin tái tổ hợp ở vỏ ngoài quả cà chua chuyển gen 89 ix DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT µg microgam 3‟UTR, 5‟ UTR Vùng 3' hoặc 5‟ không dịch mã 35S Promoter CaMV35S AS Acetosyringone Asn Asparagine BAP Benzylaminopurine bp Base pair BY2 Bright Yellow2 cDNA Complementary DNA CTAB Hexadecyltrimethyl ammonium bromide Cys Cysteine DEPC Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate E.
coli Escherichia coli E8-pro Promoter E8 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay HRP Horseradish Peroxidase HSE Heat shock Element HSP Heat shock protein HSP-pro Promoter HSP 18.2 HSP-ter Terminator HSP 18.
Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ
Trích dẫn luận án này
La Việt Hồng (2015). Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua [Luận án tiến sĩ, Viện Công nghệ sinh học]. LuanAn.net. https://luanan.net/sinh-hoc/cong-nghe-sinh-hoc/by2-re-to-thuoc-la-va-cay-ca-chua-chuyen-gen
Câu hỏi thường gặp
Luận án "Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua" nghiên cứu về vấn đề gì?
Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua nhằm ứng dụng sinh học phân tử trong nông nghiệp.
Luận án "Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua" được bảo vệ tại trường nào?
Luận án này được bảo vệ tại Viện Công nghệ sinh học. Năm bảo vệ: 2015.
Luận án "Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua" thuộc chuyên ngành gì?
Luận án "Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua" thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học. Danh mục: Công Nghệ Sinh Học.
Luận án "Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua" có bao nhiêu trang?
Luận án "Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua" có 145 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.
Cách tải luận án "Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây thuốc lá và cà chua" về máy như thế nào?
Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.