Luận án: Nghiên cứu điều kiện lên men nấm Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2021 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. Ngô Kế Sương TP Hồ Chí Minh – Năm 2021 luan an LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình Nghiên cứu sinh và Luận án Tiến sĩ, tôi đã nhận được sự quan tâm, chia sẻ, hỗ trợ của rất nhiều thầy cô, anh chị, các bạn bè cùng khoá, đồng nghiệp tại các đơn vị. Xin trân trọng cám ơn PGS.TSKH Ngô Kế Sương, người thầy đáng kính đã luôn động viên, hướng dẫn, góp ý kiến để tôi hoàn thiện Luận án. Trân trọng cám ơn TS.

Đinh Minh Hiệp đã hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin trân trọng cám ơn các thầy cô giáo của Viện Sinh học Nhiệt đới, Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Trân trọng cám ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu (TS.

Trần Minh Trang, ThS. Nguyễn Tài Hoàng) đã dành nhiều tâm huyết, thời gian, hỗ trợ tôi hoàn thành Luận án. Trân trọng cám ơn Trung ương Đoàn TNCS Hồ Chí Minh, cơ quan tôi công tác trong suốt thời gian thực hiện Luận án, đã chia sẻ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu. Và cuối cùng, tôi xin dành tình cảm, sự biết ơn đối với gia đình, những người luôn mong mỏi, âm thầm quan tâm, động viên, khích lệ để tôi hoàn thành Luận án.

luan an LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người thực hiện Lê Quốc Phong luan an MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. i DANH MỤC HÌNH .v DANH MỤC BẢNG.

vii MỞ ĐẦU. Nấm Cordyceps sinensis. Đặc điểm, phân bố. Hoạt tính sinh học.

Selen và vai trò sinh học của selen. Nguồn selen hiện nay. Vai trò của selen đối với cơ thể. Con đường chuyển hóa selen ở nấm.

Nuôi trồng nấm Cordyceps .1 Nuôi trồng Cordyceps. Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps bổ sung selen. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Địa điểm và thời gian thực hiện. Địa điểm thực hiện:. Thời gian thực hiện.

Phương pháp nghiên cứu. Chuẩn bị giống. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường PGA và môi trường lỏng PS.

Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường PGA. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường lỏng PS .3 Phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến.

Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng bổ sung selen. Sàng lọc thành phần môi trường bằng Plackett – Burman. Tối ưu hóa thành phần môi trường bổ sung selen bằng mô hình đáp ứng bề mặt Box -Behnken. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng mô hình đáp ứng bề mặt D- optimal.

Phương pháp thu nhận cao chiết. Cao chiết tổng. Cao chiết phân đoạn. Cao chiết CPS.

Thu nhận EPS. Thu nhận IPS. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết. Khả năng bắt gốc tự do ABTS.

Khả năng bắt gốc tự do DPPH. Xác định năng lực khử. Xác định khả năng bảo vệ DNA. Hoạt tính ức chế xanthine oxidase.

Đánh giá hoạt tính kháng viêm. Hoạt tính ức chế α-glucosidase. Khảo sát khả năng gây độc tế bào. Định lượng selen trong nấm Cordyceps sinensis.

Phân tích selen tổng. Phân tích selen nguyên dạng. Phân tích FT-IR. Thử nghiệm độc tính cấp của sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen 30 2.

Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .1 Về ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis .1 Ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của tơ nấm Cordyceps sinensis .2 Ảnh hưởng của selen đến sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis .3 Về nâng cao khả năng phát triển và sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường bổ sung selenate bằng phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến .2 Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy để nâng cao chuyển hóa selen trong sinh khối nấm Cordyceps sinensis .1 Sàng lọc các thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sản xuất sinh khối và tích lũy selen của nấm Cordyceps sinensis .2 Tối ưu hóa thành phần môi trường .3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy .3 Xác định thành phần hoạt chất và dạng selen chuyển hóa trong nấm Cordyceps sinensis .1 Thu nhận cao chiết từ sinh khối nấm và dịch nuôi cấy. Hàm lượng selen trong cao chiết .3 Sự hiện diện của selen trong các cao chiết chứa polysaccharide .4 Về hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis giàu selen .1 Hoạt tính kháng oxy hóa. Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS.

Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH. Hoạt tính kháng oxy hóa thông qua năng lực khử. Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bảo vệ tính nguyên vẹn của DNA. Khả năng ức chế xanthine oxidase.

Hoạt tính kháng viêm in vitro. Hoạt tính ức chế α–glucosidase. Hoạt tính ức chế tăng sinh của tế bào ung thư.6 Thảo luận chung về hoạt tính sinh học .5 Đề xuất quy trình nuôi cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen .1 Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm. Đánh giá độc tính cấp của sinh khối C.

sinensis giàu Se trên chuột .3 Đánh giá các chỉ tiêu an toàn thực phẩm .84 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.89 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .90 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .91 TÀI LIỆU THAM KHẢO .104 luan an i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt ABTS 2,2 - azinobis - (3- 2,2 - azinobis - (3- ethylbenzothiazoline - 6 - ethylbenzothiazoline - 6 - sulphonate) sulphonate) apoER2 apolipoprotein E receptor 2 apolipoprotein E receptor 2 BuOH Butanol Butanol BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bê CPT Camptothecin Camptothecin DCF 2’,7’-dichlorofluorescein 2’,7’-dichlorofluorescein DCFH Dichlorodihyddrofluorescein Dichlorodihyddrofluorescein DCFH-DA Dichloro-Dihydro- Dichloro-Dihydro- Fluorescein Fluorescein Diacetate Diacetate DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid DPPH 2,2 - diphenyl - 1 - 2,2 - diphenyl - 1 - picrylhydrazyl picrylhydrazyl ĐC Đối chứng EPS Exopolysaccharide Polysaccharide ngoại bào EtOAc Ethylacetate Ethylacetate EtOH Ethanol Ethanol FT-IR Fourier-transform infrared Quang phổ hồng ngoại spectroscopy luan an ii Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt Hep G2 Liver hepatocellular Tế bào ung thư gan Hep G2 carcinoma IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% ICP-MS Inductively coupled plasma Khối phổ plasma ghép cảm ứng Mass spectrometry Jurkat Jurkat Cell Line Dòng tế bào Jurkat IPS Intrapolysacharide Polysaccharide nội bào MeOH Methanol Metanol MT Môi trường MCF-7 Breast cancer cell line Tế bào ung thư vú NK cells Natural Killer cells Tế bào sát thủ tự nhiên NT Nghiệm thức nrSSU và The partial small subunit of Tiểu đơn vị nhỏ và tiểu đơn vị lớn dnrLSU rDNA (nrSSU) and the partial large subunit of rDNA (nrLSU) OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate buffer saline Đệm PBS PE Petroleum ether Ete dầu hỏa PGA Potato glucose agar Môi trường PGA PG Potato glucose Môi trường PG PS Môi trường PS PTN Phòng thí nghiệm ROS Reactive oxygen species Gốc oxy hóa luan an iii Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt RNI Recommended Nutrition Lượng dùng khuyến cáo hàng Intakes ngày cho người SOD Superoxide dismutase Superoxide dismutase SRB Sulforhodamin B assay Thử nghiệm độc tính SRB Se-EPS Seleno-exopolysaccharide Seleno-exopolysaccharide Se-IPS Seleno-intracellular Seleno-intracellular polysaccharide polysaccharide Se-Pr Seleno-protein Seleno-protein SeNPs Selenium nanoparticles Hạt nano selen Sul1p/Sul2p Kênh vận chuyển Sul1p/Sul2p MMP-2 Matrix Metalloproteinase-2 Matrix Metalloproteinase-2 MMP-9 Matrix Metalloproteinase -9 Matrix Metalloproteinase -9 uPA Urokinase-type plasminogen Urokinase-type plasminogen activator activator MAPK Mitogen-activated protein Mitogen-activated protein kinas kinas PDGF/ERK Platelet-derived growth Platelet-derived growth factor/Extracellular signal- factor/Extracellular signal- regulated kinase regulated kinase TGF-β1 Transforming growth factor Transforming growth factor beta 1 beta 1 ROS Reactive oxygen species Các chất oxy hóa mạnh PKA protein kinase A protein kinase A PKC protein kinase C protein kinase C luan an iv Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt TRAP The trp RNA-binding The trp RNA-binding attenuation attenuation protein protein T CD4+ T helper cells Tế bào hỗ trợ T IFNγ Interferon gamma Interferon gamma XO Xanthine oxidase Xanthine oxidase luan an v DANH MỤC HÌNH C. sinensis ngoài tự nhiên .3 Một số cấu trúc của seleno-đường .8 Sơ đồ chuỗi phản ứng giữa selente và glutathione .8 Con đường biến dưỡng chuyển hóa thành những dạng hợp chất Se khác nhau ở Saccharomyces cerevisiae .12 (A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PGA bổ sung selenite và selenate từ 0 đến 40 mgSe/L ở thời điểm 15 ngày. (B) Đường kính lan tơ của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PDA có bổ sung selen từ 0 đến 40 mgSe/L sau 15 ngày.32 (A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng có bổ sung selenite và selenate ở nồng độ 30 mgSe/L sau 40 ngày. (B) Sinh khối nấm Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng bổ sung selen từ 0 – 30 mgSe/L sau 40 ngày.

Ba nguồn selen tương ứng là selenite, selenate và selenoure.35 (A) So sánh sự sản xuất sinh khối (cột) và hấp thụ selen (đường gạch nối) bởi nấm Cordyceps sinensis giữa hai phương pháp nuôi cấy truyền thống và cải tiến sau 40 ngày. (B) Hình thái sợi nấm phát triển trên môi trường thạch sau 14 ngày và (C) sự sản xuất sinh khối của nấm trên môi trường lỏng theo các nghiệm thức tương ứng sau 40 ngày.37 So sánh hàm lượng các hợp chất chứa selen (µg/g) trong sinh khối nấm được nuôi bằng phương pháp truyền thống (PP1) và phương pháp cải tiến (PP2) .39 Bề mặt đáp ứng của sinh khối nấm Cordyceps sinensis theo hai yếu tố .51 Bề mặt đáp ứng của sinh khối C. sinensis theo hai yếu tố .55 So sánh hiệu suất chiết cao (%) giữa sinh khối nấm giàu selen (Se) và sinh khối nấm đối chứng không có selen (ĐC) .