Nghiên cứu phân lập và biểu hiện gen mã hóa protein Độc tố diệt sâu Đục quả Đậu tương (etiella zinckenella treitschke) từ vi khuẩn bacillus thuringiensis bản Địa

Cây Đậu tương là nguồn cung cấp protein thực vật và dầu thực vật quan trọng trên toàn cầu, đồng thời đóng vai trò thiết yếu trong an ninh lương thực. Tại Việt Nam, cây Đậu tương cũng là cây trồng chiến lược. Tuy nhiên, sản xuất Đậu tương thường bị đe dọa bởi nhiều loại sâu bệnh, trong đó sâu đục quả Đậu tương (Etiella zinckenella Treitschke) là một trong những loài gây hại nghiêm trọng nhất. Sâu non tấn công trực tiếp vào quả và hạt, làm giảm đáng kể năng suất và chất lượng. Thiệt hại do loài sâu này gây ra có thể lên tới 50% hoặc hơn nếu không có biện pháp kiểm soát hiệu quả. Việc quản lý loài sâu này đòi hỏi các giải pháp tích hợp và bền vững. Các biện pháp kiểm soát côn trùng gây hại truyền thống thường dựa vào thuốc trừ sâu hóa học, nhưng chúng có nhược điểm. Thuốc trừ sâu hóa học có thể gây ra hiện tượng kháng thuốc, ảnh hưởng xấu đến môi trường và sức khỏe con người. Do đó, cần thiết phải tìm kiếm các giải pháp thay thế an toàn hơn.

Bacillus thuringiensis (Bt) là một loại vi khuẩn gram dương có mặt rộng rãi trong đất. Bt nổi tiếng với khả năng sản xuất các tinh thể protein nội bào độc đáo trong quá trình sporulation. Các tinh thể này chứa các protein độc tố Bt, chủ yếu là protein Cry (Crystal protein). Protein Cry có hoạt tính diệt côn trùng đặc hiệu cao đối với nhiều loài sâu hại, bao gồm bộ cánh vảy, bộ hai cánh và bộ cánh cứng. Sau khi côn trùng ăn phải, protein Cry được hòa tan trong ruột kiềm, chuyển thành dạng hoạt động. Protein này gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên tế bào ruột giữa, tạo thành lỗ thủng và gây chết tế bào. Cơ chế này đảm bảo protein chỉ gây độc cho côn trùng mục tiêu. Nhờ tính đặc hiệu và an toàn, các chủng Bacillus thuringiensis và protein độc tố Bt của chúng đã được ứng dụng rộng rãi làm thuốc trừ sâu sinh học. Chúng cũng là nguồn gen quý giá để tạo ra cây trồng biến đổi gen kháng sâu. Công nghệ sinh học nông nghiệp đã khai thác Bt để phát triển các phương pháp kiểm soát côn trùng bền vững, giảm thiểu tác động môi trường.

Nghiên cứu đã thực hiện một quy trình sàng lọc kỹ lưỡng trên các chủng Bacillus thuringiensis từ Bộ sưu tập Bt bản địa Việt Nam. Hàng loạt chủng Bt đã được hoạt hóa và nhân nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau đó, tiến hành thử nghiệm hoạt tính diệt sâu đục quả Đậu tương (Etiella zinckenella). Các thí nghiệm này được thiết kế để định lượng khả năng gây chết sâu của từng chủng. Kết quả sàng lọc đã xác định được các chủng Bt có hoạt lực diệt sâu đục quả Đậu tương đạt từ 85% trở lên. Đây là những chủng tiềm năng để phát triển thuốc trừ sâu sinh học. Việc xác định các chủng này là bước khởi đầu quan trọng. Chúng cung cấp nguồn vật liệu di truyền phong phú để phân lập gen Cry. Nghiên cứu cũng tập trung vào việc xác định đặc điểm của tinh thể độc tố do các chủng này tạo ra. Đồng thời theo dõi động thái sinh trưởng của vi khuẩn và ảnh hưởng của chúng đến tỷ lệ chết của sâu. Thông tin này rất cần thiết để chọn lọc các chủng mạnh nhất cho các bước nghiên cứu tiếp theo về phân lập gen và biểu hiện protein độc tố Bt.

Sau khi xác định được 4 chủng Bacillus thuringiensis có độc lực cao với sâu đục quả Đậu tương, nghiên cứu tiếp tục giải trình tự hệ gen của các chủng này. Công nghệ SMRT Sequencing của PacBio đã được sử dụng để thu được dữ liệu trình tự chất lượng cao. Các gen mã hóa protein độc tố Bt tiềm năng được khai thác từ cơ sở dữ liệu hệ gen Bt bằng công cụ tin sinh học như BtToxin_scanner. Việc này giúp xác định các trình tự gen Cry mới hoặc các biến thể của gen đã biết. Phân tích tin sinh học đóng vai trò then chốt trong việc nhận diện các gen độc tố có khả năng diệt trừ sâu đục quả Đậu tương. Các gen Cry mới này có thể mang lại hoạt tính độc đặc hiệu cao hơn hoặc phổ tác động rộng hơn. Kết quả phân tích đã chỉ ra sự hiện diện của một số gen Cry tiềm năng. Đây là cơ sở để tiến hành phân lập, tách dòng và kiểm tra hoạt tính của protein độc tố Bt tương ứng. Việc tìm kiếm các gen Cry mới là yếu tố then chốt để đa dạng hóa các giải pháp kiểm soát côn trùng gây hại, chống lại sự phát triển của tính kháng thuốc.

Từ cơ sở dữ liệu trình tự hệ gen của 4 chủng Bacillus thuringiensis có độc lực cao, các gen độc tố Cry tiềm năng đã được phân tích và lựa chọn để phân lập. Quy trình phân lập gen cry bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu. DNA hệ gen của các chủng Bt đã chọn được dùng làm khuôn. Sau khi khuếch đại, các đoạn gen cry được tách dòng vào các vector phù hợp. Bước tiếp theo là xác định trình tự nucleotide của các gen cry đã phân lập. Trình tự này sau đó được so sánh với các gen độc tố Bt đã được công bố trên các cơ sở dữ liệu gen. Mục tiêu là để xác định xem các gen này là mới hay có mức độ tương đồng cao với các gen đã biết. Kết quả cho thấy đã phân lập và xác định được trình tự của các gen như cry1Na, cry2Ab, cry2Ah và cry1Be. Việc này khẳng định sự hiện diện của các gen Cry đa dạng trong các chủng Bt bản địa. Các gen này là ứng cử viên sáng giá cho việc phát triển các protein độc tố Bt mới, có hiệu quả trong kiểm soát côn trùng gây hại.

Sau khi phân lập và tách dòng thành công các gen cry, bước tiếp theo là biểu hiện các gen này để thu được protein độc tố Bt tái tổ hợp. Các gen cry1Na, cry2Ab, cry2Ah và cry1Be đã được chèn vào các vector biểu hiện như pET32a(+). Các vector này được thiết kế để biểu hiện protein trong hệ thống tế bào E. coli BL21. Vi khuẩn E. coli tái tổ hợp được nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện gen. Quá trình biểu hiện được thực hiện trong các điều kiện tối ưu để đảm bảo sản xuất lượng protein tối đa. Protein tái tổ hợp thu được sau đó được tinh sạch bằng các phương pháp sắc ký. Sau khi tinh sạch, các protein độc tố Bt được đánh giá hoạt tính diệt sâu đục quả Đậu tương (Etiella zinckenella). Thí nghiệm này là để kiểm tra trực tiếp hiệu quả sinh học của protein. Kết quả đã chứng minh rằng protein tái tổ hợp từ các gen cry này có khả năng gây độc cho sâu. Điều này xác nhận các gen đã phân lập thực sự mã hóa protein độc tố Bt có hoạt tính, mở ra tiềm năng cho thuốc trừ sâu sinh học.

Để tối đa hóa sản lượng protein độc tố Cry2Ab tái tổ hợp hòa tan, nghiên cứu đã tiến hành tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện trong tế bào E. coli BL21. Các yếu tố chính được khảo sát bao gồm nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng và nồng độ IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng đã được đánh giá ở các mức độ khác nhau. Nhiệt độ thấp hơn thường giúp protein cuộn gấp đúng cách và tăng độ hòa tan. Tương tự, nồng độ IPTG cũng được tối ưu để đạt được mức độ cảm ứng gen phù hợp. Nồng độ IPTG quá cao có thể dẫn đến sự hình thành các thể vùi (inclusion bodies) không hòa tan. Mục đích là tìm ra sự cân bằng giữa sản lượng và độ hòa tan của protein. Kết quả tối ưu cho thấy việc điều chỉnh nhiệt độ và nồng độ IPTG có thể làm tăng đáng kể lượng protein Cry2Ab hòa tan thu được. Điều này rất quan trọng để có đủ lượng protein cho các thử nghiệm hoạt tính tiếp theo. Việc tối ưu hóa giúp nâng cao hiệu quả sản xuất protein độc tố Bt trong phòng thí nghiệm.

Protein độc tố Cry2Ab tái tổ hợp đã được tinh sạch thành công sau quá trình tối ưu hóa biểu hiện. Sau đó, protein tinh sạch được sử dụng để đánh giá hoạt tính diệt sâu đối với ấu trùng sâu đục quả Đậu tương (Etiella zinckenella). Nghiên cứu đã xác định giá trị liều gây chết trung bình (LC50) của protein Cry2Ab tinh sạch. LC50 là một chỉ số quan trọng đo lường độc tính của một chất, cho biết liều lượng cần thiết để gây chết 50% quần thể đối tượng. Các thí nghiệm độc tính được thực hiện bằng cách cho ấu trùng sâu ăn thức ăn có chứa các nồng độ protein Cry2Ab khác nhau. Sau một khoảng thời gian nhất định, tỷ lệ chết của sâu được ghi nhận và phân tích thống kê để tính toán LC50. Kết quả này cung cấp bằng chứng định lượng về hiệu quả của protein Cry2Ab trong việc kiểm soát côn trùng gây hại. Đây là thông tin thiết yếu cho việc phát triển protein này thành một thành phần của thuốc trừ sâu sinh học, góp phần vào các chiến lược kiểm soát côn trùng bền vững.

Để đảm bảo gen cry2Ab39 có thể biểu hiện hiệu quả trong tế bào thực vật, nghiên cứu đã tiến hành tối ưu hóa mã di truyền của gen này. Các codon trong trình tự gen được thay đổi để phù hợp với tần suất sử dụng codon ưu tiên của cây Đậu tương và các loài thực vật khác. Việc này giúp tăng cường hiệu quả dịch mã và sản xuất protein Cry2Ab39 với số lượng lớn trong cây trồng. Ngoài ra, các yếu tố như hàm lượng GC, trình tự lặp lại và các cấu trúc bậc hai không mong muốn cũng được xem xét và điều chỉnh. Mục đích là loại bỏ các yếu tố có thể gây ức chế biểu hiện gen hoặc giảm độ bền của mRNA trong thực vật. Gen cry2Ab39 đã được tối ưu hóa (cry2Ab39opt) sẽ được chèn vào các vector chuyển gen thực vật. Quá trình tối ưu hóa mã di truyền là một bước quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp để tạo ra cây trồng biến đổi gen kháng sâu. Nó đảm bảo rằng protein độc tố Bt được sản xuất đầy đủ và hoạt động hiệu quả trong mô thực vật, bảo vệ cây khỏi sâu đục quả Đậu tương.

Sau khi tối ưu hóa mã di truyền của gen cry2Ab39, các vector chuyển gen thực vật đã được thiết kế. Các vector này, như pFGC/35S_cry2Ab39opt, chứa gen cry2Ab39 đã tối ưu dưới sự điều khiển của các promoter thực vật mạnh. Để nhanh chóng kiểm tra khả năng biểu hiện của gen trong môi trường thực vật, phương pháp agroinfiltration đã được sử dụng. Trong kỹ thuật này, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen được tiêm vào lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Agrobacterium sẽ chuyển đoạn T-DNA mang gen cry2Ab39 vào tế bào lá, dẫn đến sự biểu hiện tạm thời của protein Cry2Ab39. Quá trình này cho phép đánh giá hiệu quả sản xuất protein độc tố Bt trong mô thực vật mà không cần phải tạo cây chuyển gen ổn định. Việc phát hiện sự hiện diện và mức độ biểu hiện của protein Cry2Ab39 trong lá thuốc lá xác nhận rằng gen đã tối ưu hoạt động tốt trong hệ thống thực vật. Đây là một bước thử nghiệm quan trọng trước khi tiến hành chuyển gen vào cây Đậu tương, hướng tới phát triển cây trồng kháng sâu đục quả Đậu tương (Etiella zinckenella) hiệu quả.