Luận án Tiến sĩ CN sinh học: Chỉ thị phân tử nhận dạng & Nhân giống Xáo tam phân P. trimera

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Chu Hoàng Hà. Các kết quả thu được trong luận án Hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Phí Thị Cẩm Miện ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án, tôi xin trân trọng cảm ơn sâu sắc đến PGS.

Chu Hoàng Hà, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Các Thầy Cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Công nghệ sinh học; Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh hoạt chuyên môn và thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn đến Học Viện Khoa học và Công Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình dự án Việt Bỉ (AI Programe-VNUA, 2014-2019) đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài “A study of phylogenetics and biopharmaceutical properties of the Vietnamese traditional medicinal plants belonging to the genus Paramignya for the development of hepatoprotective nutraceuticals” giai đoạn 2018-2019 để giúp tôi có nguồn kinh phí thực hiện các nội dung nghiên cứu của Luận án.

Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Phí Thị Cẩm Miện iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.

vi DANH MỤC CÁC BẢNG. vii DANH MỤC HÌNH. ix MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu tổng quát. Mục tiêu cụ thể. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài. Đối tượng nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu chung về chi Paramignya.

Đặc điểm sinh học của chi Paramignya. Một số thành phần hóa học và hoạtt tính sinh học chi Paramignya. Cây Xáo tam phân (P. trimera), phân loại, đặc điểm sinh học và hoạt chất sinh học.

Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại Xáo tam phân. Đặc điểm thực vật học của cây Xáo tam phân tại Việt Nam. Nghiên cứu về hoạt tính sinh dược học của cây Xáo tam phân. Các phương pháp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật.

Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật. DNA barcode và ứng dụng của DNA barcode để nhận dạng và phân biệt loài. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định quan hệ tiến hóa. Đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật.

Các nghiên cứu về hệ thống học, DNA barcodes của các loài thuộc chi Paramignya và loài P. Nhân giống loài Xáo tam phân. Nhân giống Xáo tam phân trong tự nhiên .49 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh của các mẫu thu thập. Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân. Các chỉ thị phân tử DNA.

Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu và xây dựng bản đồ phân bố. Phương pháp mô tả hình thái.

Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số. PCR nhân các vùng microsatellite bằng các chỉ thị SSR. PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử. Giải trình tự và đăng ký trình tự.

Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự. Phương pháp nhân giống in vitro cây Xáo tam phân. Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng sinh trưởng Xáo tam phân trong điều kiện in vitro.

Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins và auxin tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân. Ảnh hưởng của nhóm auxin tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân. Phương pháp bố trí và xử lý thí nghiệm .69 v CHƯƠNG III.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Khảo sát sự phân bố và đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya tại Khánh Hòa và Lâm Đồng. Khảo sát thành phần loài và sự phân bố của các mẫu nghiên cứu. Đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya.

Tách chiết DNA tổng số, nhận dạng loài thông qua chỉ thị barcode. Xác định đa dạng di truyền của các mẫu Xáo tam phân dựa vào chỉ thị SSR. Nghiên cứu chỉ thị DNA và nhận dạng loài. PCR và xác định trình tự các vùng chỉ thị DNA.

Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST. Xây dựng chỉ thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P. Khảo sát dữ liệu DNA mã vạch của các loài thuộc chi Paramignya. Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự thuộc chi Paramignya.

So sánh các trình tự để nhận dạng và phân biệt Xáo tam phân. Xây dựng cây tiến hóa giữa các loài. Xây dựng chỉ thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân. Đánh giá chỉ thị phân tử dựa vào phân tích khoảng cách mã vạch.

Nhân giống in vitro Xáo tam phân. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân. Nghiên cứu xác định môi trường nền phù hợp với nhân nhanh in vitro Xáo tam phân. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinins tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân .131 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.132 TÀI LIỆU THAM KHẢO .141 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABDG : Automatic Barcode Gap Discovery AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism BAP : 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine BI : Bayesia interference CSDL : Cơ sở dữ liệu CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide CV : Coefficient of Variation DNA : Deoxyribonucleic acid IAA : Acid indoleacetic IBA : 3-Indolebutyric acid ITS : Internal transcribed spacer ITS : Internal transcribed spacer KC : Knudson C medium LSD : Least significant differential LSD0.05 : Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0.05 matK : Maturase K MS : Murashige & Skoog medium MSA : Multiple sequence alignment NCBI : National Center for Biotechnology Information P. trimera : Paramignya trimera PCR : Polemerase Chain Reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic rbcL : Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SSR : Simple sequence Repeat STS : Silver thiosulfate TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium-Lloyd G, Mc Cown B, 1980 α - NAA : Axit α-naphtyl axetic 2.4-Dichlorophenoxyacetic vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Tổng hợp các chỉ thị phân tử sử dụng đối với genome lục lạp. Bảng mẫu sử dụng tách chiết DNA, phân tích quan hệ phát sinh.

Trình tự mồi SSR sử dụng. Trình tự mồi ITS, matK và rbcL. Tổng hợp vị trí thu thập các mẫu tại Khánh Hòa và Lâm Đồng. Số allen và hệ số PIC của 31 cặp mồi SSR.

Tổng hợp thông tin về DNA barcode của các loài thuộc chi Paramignya trong hệ thống BOLD. Tổng hợp các dữ liệu trình tự của các loài thuộc chi Paramignya. Tổng hợp các vùng trình tự ITS, matK và rbcL của các trình tự. Khoảng cách trong loài và giữa loài của các dữ liệu trình tự.

Ảnh hưởng của dung dịch nano bạc tới khả năng tạo mẫu sạch Xáo tam phân. Ảnh hưởng của dung dịch Johnson tới khả năng tạo mẫu sạch Xáo tam phân. Ảnh hưởng sự kết hợp của dung dịch Johnson và nano bạc tới khả năng khử trùng tạo mẫu sạch Xáo tam phân. Ảnh hưởng của môi trường nền tới sự sinh trưởng, nhân nhanh Xáo tam phân.

Ảnh hưởng của TDZ, IBA và 2.4 D tới khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa TDZ, IBA và 2.4D tới sự phát sinh mô sẹo IBA Xáo tam phân. Ảnh hưởng của BA tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân. Ảnh hưởng của TDZ tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân.

Ảnh hưởng của nhóm sự kết hợp giữa BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và α-NAA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và IBA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân. Ảnh hưởng của IBA và α-NAA tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân in vitro.

Ảnh hưởng của một số loại giá thể tới khả năng sống của cây con in vitro .125 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc các hợp chất coumarin từ chi Paramignya. Hình ảnh cây Xáo tam phân trồng tại khu thí nghiệm Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Hình ảnh lá Xáo tam phân tại Khánh Hòa, Việt Nam.

Hình ảnh thân, rễ Xáo tam phân tại Khánh Hòa, Việt Nam. Hình ảnh cụm hoa cây Xáo tam phân tại xã Ninh Vân, Khánh Hòa. Cấu tạo hình thái lá, hoa Xáo tam phân. Hình ảnh quả cây Xáo tam phân thu được tại Khánh Hòa, Việt Nam.

Các phương pháp xây dựng cây tiến hóa. Sơ đồ xây dựng chỉ thị DNA đặc thù. Sơ đồ xây dựng CSDL DNA barcode. Quy trình xác định chỉ thị phân tử DNA barcode.

Bản đồ địa bàn nghiên cứu vị trí thu thập mẫu và tình trạng phân bố các loài P. trimera và một số loài khác thuộc chi Paramignya. Bản đồ địa bàn nghiên cứu gồm vị trí điểm lấy mẫu và phân bố của các loài Xáo tam phân Paramignya trimera. Bản đồ địa bàn nghiên cứu gồm vị trí điểm lấy mẫu và phân bố của các loài.

Đặc điểm hình thái của Paramignya trimera (Oliv. Đa dạng về hình thái lá của cây Xáo tam phân P. Đặc điểm lá và cành của P. andamanica King thu thập tại Khánh Hòa, Việt Nam.

Đặc điểm hình thái của P. Đặc điểm hình thái thân, lá của P. Đặc điểm lá của P. rectispinosa thu thập tại Cát Tiên, Lâm Đồng.

DNA tổng số của các mẫu P.trimera và 4 loài thuộc chi Paramignya. Kết quả phân tích đa hình các mẫu Paramignya bằng chỉ thị SSR của một số cặp mồi điển hình. Mối quan hệ di truyền của các loài thuộc chi Paramignya. Ma trận khoảng cách giữa các mẫu phân tích .