Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu hoạt tính sinh học của cao chiết khổ sâm (Sophora flavescens) trồng tại Tây Nguyên - Cao Ngọc Minh Trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- CAO NGỌC MINH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.) TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- CAO NGỌC MINH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.) TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Ngô Đại Nghiệp 2. Hoàng Nghĩa Sơn Thành phố Hồ Chí Minh – 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận n n y l công tr nh nghi n cứu của tôi ƣ i s hƣ ng ẫn khoa học của PGS. Ngô Đại Nghiệp v GS.

Ho ng Nghĩa Sơn. C c số liệu kết quả trong luận n l trung th c v m t phần đƣ c công ố trong c c tạp chí chuy n ngành. Những trích ẫn v t i liệu tham khảo trong luận n có nguồn gốc x c th c. Th nh phố Hồ Chí Minh ng y 05 tháng 5 năm 2022 T c giả luận n, Cao Ngọc Minh Trang ii LỜI CẢM ƠN Lu h h h i i n Sinh học Nhi ới, Học vi n Khoa học và Công ngh - Vi H h họ g gh Vi N T g h ghi gi h hi gi ể hoàn thành lu n án này.

Tôi xin trân trọng c ơ ới: - PGS. Ng Đ i Nghi GS TS H g Nghĩ Sơ - h g g i Th h ớ g h họ g i và ọi i i n thu i h i g h i gi h hi n lu - PGS. Nguyễn Thị Ph ơ g Th o, TS. Lê Thành Long và các ồng nghi p ó h ng góp ý quý báu cho tôi trong quá trình nghiên c u và hoàn thi n lu n án.

- Học vi n Khoa học và Công ngh - Vi H h họ g gh Vi t Nam, h i n Sinh học Nhi ới, gi i ki n thu i h i g h họ ghi - DS. Nguyễn Tiến Hùng – Cty Cổ ph YD c phẩm Vimedimex 2, ThS. Nguyễn Huy Vỹ - Trung tâm Kiểm nghi h D ơ g, ThS Nguyễn Khắc M nh – Vi n Nhi ới M i T ng gi thu th p và hỗ tr phân tích m u trong quá trình th c hi tài. - Ban Giám hi u T g Đ i họ ă L g, Ban chủ nhi m khoa CNSH, Khoa Công ngh , Khoa Công ngh ng dụng và ồ g ghi ủ gh i i n thu i h i g h i gi ghi i h T i i g iế ơ ắ h ới gi h g i h và b n bè h h ng vi i g h họ ghi Tác giả Cao Ngọc Minh Trang iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC.

iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC BẢNG. viii DANH MỤC HÌNH. ix MỞ ĐẦU .Tổng quan về th c vật học Khổ Sâm.

Vị trí phân loại. Mô tả đặc điểm hình thái. Phân bố sinh thái, thu hái và chế biến. Thành phần hóa học.

Tác dụng ƣ c lý của Khổ Sâm. Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa. Gốc t do và stress oxy hóa. Chất kháng oxy hóa.

Hoạt tính kháng oxi hóa của flavonoid trong rễ cây Khổ sâm. Tổng quan về hoạt tính kháng tế o ung thƣ:. Quá trình Apoptosis. Quá trình Necrosis.

Hoạt tính kháng ung thƣ từ rễ Khổ sâm. Dòng tế o ung thƣ gan. Dòng tế bào ung thu vú. Phƣơng ph p x c định matrine và oxymatrine trong Khổ sâm.

Định tính v định lƣ ng matrine. Phân lập matrine và oxymatrine làm chất đối chiếu. VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP. Đối tƣ ng nghiên cứu.

Địa điểm, thời gian nghiên cứu. Thiết bị sử dụng. Phƣơng ph p nghi n cứu. Định anh v đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu.

Chiết xuất ƣ c liệu Khổ sâm định hƣ ng phân lập alkaloid matrine và oxymatrine. Định lƣ ng polyphenol và flavonoid tổng số. Phƣơng ph p x c định hoạt tính kháng oxy hóa. Nuôi cấy tế bào.

Hoạt tính kháng tế o ung thƣ HepG2 v BT474 của các cao chiết phân đoạn từ rễ Khổ sâm. Phƣơng ph p thống kê. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN. Định anh v đánh giá chất lƣ ng ƣ c liệu.

Định danh loài cây Khổ sâm trồng tại Tây Nguyên. Đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu. Kết quả tách chiết m t số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm. Phân lập Matrine và Oxymatrine bằng phƣơng ph p sắc ký điều chế.

X c định tổng polyphenol và tổng flavonoi trong ƣ c liệu. Định tính thành phần flavonoi trong ƣ c liệu. Định lƣ ng h p chất polyphenol tổng số (TPC). Định lƣ ng flavonoid tổng số.

Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết rễ Khổ sâm. Kết quả ức chế các tế o ung thƣ. Ảnh hƣởng cao chiết phân đoạn t i s tăng sinh của tế bào HepG2 và BT474. Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên mật đ tế bào, hình thái tế bào và nhân.

Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên chu kì tế bào. Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên quá trình Apoptosis.73 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .81 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. 82 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ. 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………….95 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS : 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid ACN : Acetonitrile AIDS : Acquired Immuno-deficiency Syndrome (h i chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) AR : Analytical Reagent (thuốc thử dùng cho phân tích) ATCC : American Type Culture Collection (B sƣu tập giống của Mỹ) BT474 : Breast Tumor 474 (Dòng tế o ung thƣ vú BT474) DĐTQ : Dƣ c điển Trung Quốc DĐVN : Dƣ c điển Việt Nam DMEM : Môi trƣờng Dulbecco's Modified Eagle DMSO : Dimethylsulfoxide DNPH : 2,4-dinitrophenylhydrazin DPPH• : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA : Ethyl acetate EDTA : Ethylendiamintetraacetic acid disodium salt EtOH : Ethanol FCR : Folin–Ciocalteu Reagent (thuốc thử Folin-Ciocalteu) FRAP : Ferric Re ucing Antioxi ant Power (năng l c khử sắt) FV : FRAP Value (chỉ số FRAP) GAE : Gallic acid Equivalent (đƣơng lƣ ng gallic acid) GSH : Glutathione HepG2 : Hepatoma G2 (Dòng tế o ung thƣ gan HepG2) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HRMS : High Resolution Mass Spectrometry (Khối phổ phân giải cao) IC50 : Inhibition concentration at 50 % (nồng đ ức chế 50 %) LOD : Loss On Drying (Mất khối lƣ ng do làm khô) vii OD : Optical Density (Mật đ quang) PBS : Phosphate-buffered saline QE : Quercetin Equivalent (đƣơng lƣ ng quercetin) RT- PCR: Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction Rf : Retention factor (chỉ số lƣu giữ) RNS : Reactive Nitrogen Species (Các gốc t do chứa Ni tơ) ROS : Reactive Oxygen Species (Các gốc t do chứa Oxy) SFNP : Sophora Flavescens Nanoparticles SPE : Solid phase extraction (Chiết pha rắn) TFC : Total Flavonoid Content (hàm lƣ ng flavonoid tổng số) TLC : Thin layer Chromatography (Sắc ký l p mỏng) TPC : Total Phenolic Content (h m lƣ ng h p chất polyphenol tổng số) viii DANH MỤC BẢNG B ng 1.1: M t số dạng gốc t do .2: Tính chất hóa lý của matrine và oxymatrine .1: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu.2: Chƣơng tr nh pha đ ng phân tách matrine và oxymatrine .3: Chƣơng tr nh pha đ ng hệ sắc ký điều chế .4: Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime RT- PCR cho các gene liên quan t i s chết theo chƣơng tr nh.5: Trình t cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng định lƣ ng Realtime RT- PCR .1: Kết quả search last NCBI .2: Kết quả đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết của nguyên liệu.3: Chƣơng tr nh pha đ ng HPLC-UV phân tách matrine và oxymatrine .4: Khảo sát tỉ lệ dung môi EtOH chiết matrine và oxymatrine từ rễ Khổ sâm .5: Các thông số thẩm định phƣơng ph p HPLC-UV x c định matrine và oxymatrine.6: H m lƣ ng matrine và oxymatrine trong cao phân đoạn EtOH 80 %, EA, CHCl3 v cao nƣ c .7: Tối ƣu l m sạch dịch chiết ƣ c liệu trên c t OASIC MCX, sử dụng 200 mg cao CHCl3 cho ƣ c khảo sát này.8: Nhận danh flavonoid trong cao EA bằng HPLC-HRMS .9: Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết rễ Khổ sâm .61 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: B phận trên mặt đất (A) và rễ (B) của Khổ sâm .2: M t số thành phần alkaloid của Khổ sâm.3: Khung cấu trúc chung của flavonoid .4: Phân iệt s kh c nhau giữa Apoptosis v Necrosis .5: Dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 .6: Dòng tế o ung thƣ vú BT474 .1: Sơ đồ quy trình chiết xuất khảo sát .1: (A), (B) hình thái cây Khổ sâm 2 năm tuổi đƣ c trồng tại Đắk Nông và thu hái vào tháng 3/2016, (C) hoa Khổ sâm, (D) rễ Khổ sâm tƣơi (E) rễ Khổ sâm phơi khô, (F) mặt cắt ngang của rễ Khổ sâm khô, (G), rễ Khổ sâm khô chặt nhỏ, (H) b t rễ Khổ sâm.2: (A) Tinh b t vi phẫu và (B) vi phẫu mặt cắt ngang rễ Khổ sâm .3: M t số thành phần b t rễ Khổ sâm quan s t ƣ i kính hiển vi quang học (X10) .4: Phản ứng v i NaOH của rễ Khổ sâm phơi khô .5: Kết quả định tính alkaloi trong ƣ c liệu .6: Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn matrine và oxymatrine .7: Cấu trúc pha tĩnh c t OASIS MCX .8: Sắc ký đồ điều chế matrine và oxymatrine .9: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của matrine điều chế.10: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của oxymatrine điều chế .11: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao chiết EA .12: Tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ gallic acid và đ hấp thu quang 765 nm.13: Tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ quercetin và đ hấp thu quang ở 415 nm.14: Phân bố TPC và TFC trong b t rễ Khổ sâm và các loại cao .15: Ảnh hƣởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào HepG2 .16: Ảnh hƣởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào BT474 .