Tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà plumbago zeylanica l và khảo sát khả năng tạo plumbagin trong nuôi cấy in vitro - Nghiên cứu sinh Bùi Đình Thạch

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận án Nghiên cứu sinh Bùi Đình Thạch ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành nghiên cứu này, tác giả xin chân thành cảm ơn: - Các thầy giáo hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Hổ và PGS.

Ngô Kế Sương luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu. - Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Bộ phận đào tạo sau Đại học của Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi và quan tâm sâu sắc trong công việc và thực hiện nghiên cứu. - Các Thầy/Cô, Anh/Chị, Đồng nghiệp và Bạn bè đã hỗ trợ trong công tác chuyên môn, ủng hộ tinh thần và cho những ý kiến xác đáng trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Đặc biệt, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến Ba, Mẹ và Gia đình luôn hỗ trợ về vật chất và tinh thần.

Nghiên cứu sinh Bùi Đình Thạch iii TÓM TẮT Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) là một cây dược liệu quan trọng, rễ cây chứa thành phần chính là Plumbagin, một naphthoquinone có nhiều đặc tính dược liệu được quan tâm, như: kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng côn trùng. Với mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu chứa hàm lượng Plumbagin cao thông qua nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà, trên cơ sở: chọn cơ quan thực vật phù hợp dùng chuyển gen; xác định hiệu quả chuyển gen dưới tác động đồng thời của thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone; xác định tác động đồng thời của một số yếu tố (điều kiện nuôi cấy, môi trường, dinh dưỡng và elicitor) lên khả năng sinh trưởng, tích lũy Plumbagin trong rễ tơ và đánh giá biểu hiện tác động kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin. Kết quả nghiên cứu đã xác định lá là cơ quan được chọn để chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà, có sự tác động đồng thời giữa thời gian ủ và hàm lượng acetosyringone lên hiệu quả chuyển gen theo đó Acetosyringone 134,09 µM và 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,025%). Khả năng phát triển của rễ tơ cây Bạch hoa xà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, theo đó: môi trường MS, rễ được nuôi ở điều kiện tối và môi trường ở dạng lỏng là điều kiện tối ưu cho sự phát triển sinh khối rễ tơ.

Sử dụng ma trận Plackett-Burman (Plackett, Burman 1946) để đánh giá tác động đồng thời của nhiều yếu tố (dinh dưỡng và elicitor) lên khả năng sinh trưởng và tích lũy Plumbagin, qua đó đã chọn lọc và xác định được điều kiện môi trường nuôi cấy rễ tơ có bổ sung: nước dừa: 14,30%, chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L thu được kết quả tối ưu với trọng iii lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g và hàm lượng Plumbagin: 13,135 mg. Ngoài ra, hoạt tính của Plumbagin cũng được kiểm chứng qua việc cảm ứng sự biểu hiện các đặc điểm hình thái cũng như thay đổi sự cân bằng trong biểu hiện một số gene liên quan tới quá trình chết của tế bào HepG2, thông qua mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm, sự phân mảnh của nhân và sự biểu hiện của gene (bax và bcl-2) liên quan đến quá trình apoptosis. iv ABSTRACT Plumbago zeylanica L. is an important pharmaceutical plant.

Its roots contain high quantity of Plumbagin, a naphthoquinone that has positive effects against cancer cells, bacteria, fungi as well as insects. This research aims to produce Plumbagin sources through culturing Plumbago zeylanica L. hairy roots on the selection of suitable plant segment for transgene. The study also identifies the transgene efficiency under effects of incubation time and acetosyringone concentration; identifies other factors (culturing condition, media, nutrition and elicitor) on plant growth and plant capacity to accumulate Plumbagin in hairy roots and evaluates anticancer effect of Plumbagin on liver carcinoma.

This study showed that the highest transgenic efficiency (0.025%) was achieved when leaf segment was used to generate transgenic hairy roots in 3.47 days of incubation with Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 at 134. hairy roots showed to be grow best in liquid MS media and in dark condition. Using Plackett-Burman (Plackett Burman, 1946) matrix to analyse efficiency of co-factors, the optimum condition for hairy roots to grow and accumulate Plumabagin was media supplemented with 14.30 % coconut water, 100 mg/L chitosan, 19.40 mg/L salicyclic acid and 500 g/L peptone. With the listed condition, the best result achieved were 5.268 g fresh weigh and 0.46 g dry weight of hairy roots, with plumbagin content was 13.

Besides, plumbagin had effects on physiology of liver cancer cells. It also affects some apoptotic genes of HepG2 cells. The results showed that there were iv a reduction in number of HepG2 cells, fragmentation in nucleus and expression of apoptotic bax and bcl-2 genes. v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

iv MỤC LỤC. v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC BẢNG. vii DANH MỤC HÌNH.

viii MỞ ĐẦU. Cây Bạch hoa xà. Nguồn gốc và phân loại. Đặc điểm hình thái.

Thành phần hóa học. Công dụng của dịch trích ly từ rễ cây BHX. Cấu trúc và đặc tính hóa học. Sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật.

Hoạt tính của Plumbagin. Hoạt tính kháng oxy hóa. Hoạt tính kháng viêm. Hoạt tính kháng ung thư.

Hoạt tính kháng khuẩn. Hoạt tính kháng nấm. Độc tính của plumbagin. Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật.

Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật. Hợp chất thứ cấp từ thực vật. Con đường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp. Dược tính của các hợp chất thứ cấp từ thực vật.

Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp. Sự hình thành rễ tơ ở thực vật. Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes. Ri-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.

Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật. Sự biểu hiện của các gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trong mô thực vật. Tạo rễ tơ ở thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes. Nuôi cấy rễ tơ ở thực vật.

Ảnh hưởng của dòng rễ tơ. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy. Ảnh hưởng của elicitor. Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hoạt chất thứ cấp.

48 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. Nguyên vật liệu. Môi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp thực nghiệm.

Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho chuyển gen. Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu. Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro.

Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ. Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi khuẩn hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR.

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt chất plumbagin trong nuôi cây rễ tơ cây Bạch hoa xà. Ảnh hưởng trạng thái môi trường. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ.

Ảnh hưởng khối lượng ban đầu. Xác định đường cong tăng trưởng. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ.

Ly trích và chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC). Định lượng Plumbagin bằng HPLC. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin.

Xử lý số liệu. 68 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro. Xác định điều kiện khử trùng mẫu.

Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa xà in vitro. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà.

Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ. Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin. Trạng thái môi trường.

Điều kiện chiếu sáng. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy .Xác định đường cong tăng trưởng. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy.

Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin. 107 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 108 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. 109 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ.

110 TÀI LIỆU THAM KHẢO. vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3MeDAB Aminoazobenzene 3-methyl-4-dimethyl BHX Bạch hoa xà AQ Anthraquinone BRCA Breast cancer CADs Caffeic acid CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Con A Concanavalin A ER Estrogen receptor GHS Glutathione HaCaT Human keratinocyte line HEK Human Embryonic Kidney IL Interleukin MeJA Methyl jasmonate MMPs Matrix metalloproteinases NPAAs Non-protein amino acids vi NSCLC Non-small cell lung cancer OCD Ornithine cyclodeaminase ROS Reactive oxygen species SM Secondary metabolism TLK Trọng lượng khô NT Nghiệm thức TLT Trọng lượng tươi TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate NF-kB Nuclear factor-kappaB NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PARP Poly polymerase ADP-ribose MMP-2 Matrix metalloproteinase-2 ABCG2 ATP-binding cassette sub-family G member 2 SA Salicylic acid Trp Tryptophan McC McCown-Lloyd MS Murashige and Skoog vi B5 Gamborg's B-5 BA 6-benzyladenine NAA Naphthalene Acetic Acid IAA Indole-3-acetic acid GA3 Gibberellin A3 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid IBA Indole-3-butyric acid GSH Glutathione GSL Glucosinolate SIR Sulfur induced resistance vii DANH MỤC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 1.1 Một số kết quả ghi nhận trong nghiên cứu in vitro thu nhận 16, 17, Plumbagin. Điều kiện khử trùng đoạn thân cây Bạch hoa xà để tạo mẫu in 49 vitro. Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thử nghiệm 51 tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây Bạch hoa xà.