Luận án tiến sĩ: Phân lập nhân giống nấm đầu khỉ Hericium erinaceus & tách chiết polysaccharide - TS. Cồ Thị Thùy Vân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== Cồ Thị Thùy Vân NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== Cồ Thị Thùy Vân NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Lê Mai Hương 2. Trần Liên Hà Hà Nội - 2015 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi; các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình của tác giả nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2015.

TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn Nghiên cứu sinh Giáo viên HD 1 PGS. Lê Mai Hƣơng Cồ Thị Thuỳ Vân CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Lê Mai Hương, Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và PGS. Trần Liên Hà, Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để tôi hoàn thành Luận án này; Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu cũng như giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trường; Đồng thời xin được gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ, cộng tác của các cán bộ phòng Nghiên cứu – Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp; các cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam; Tôi xin cảm ơn GS.

Trịnh Tam Kiệt đã cho tôi những lời khuyên và chỉ dẫn cho tôi rất nhiều kiến thức về nấm lớn. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập được giao. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Cồ Thị Thùy Vân CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ MỤC LỤC TRANG MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 5 1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất và sử dụng nấm dƣợc liệu 5 1.

Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu 5 1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc 10 sức khỏe cộng đồng 1. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính 15 sinh học trong nấm dược liệu 1.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính 16 sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta 1. Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.

Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull. Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học 18 1. Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấm 18 Đầu khỉ 1. Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H.

Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ 19 1. Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho 20 nấm Đầu khỉ 1. Tình hình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và trong nước 25 1. Một số phương pháp được sử dụng để tách polysaccharide từ quả 30 thể và hệ sợi nấm dược liệu 1.

Phương pháp tách chiết trong cồn 30 1. Phương pháp tách chiết trong nước nóng 30 1. Phương pháp tách chiết trong kiềm nóng kết hợp với sự 31 hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm 1. Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự 32 hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.

Các loại môi trƣờng 36 2. Phƣơng pháp nghiên cứu 39 2. Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập 39 giống nấm Đầu khỉ i CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 2. Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ 39 2.

Phân lập giống nấm Đầu khỉ 40 2. Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân 41 lập giống gốc 2. Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ 41 2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu 42 khỉ dạng dịch thể các cấp.

Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung 42 tích 200 ml) 2. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 (dung 43 tích 2000 - 5000 ml) 2. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng trong nuôi 44 trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp (dung tích 120 lít) 2. Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch 45 thể 2.

Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ 46 trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể. Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ 46 2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ 47 trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể. Phương pháp bố trí thí nghiệm 47 2.

Phương pháp xác định một số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit 49 amin trong nấm Đầu khỉ 2. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận 49 polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ 2. Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể 49 nấm nấm Đầu khỉ 2. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 50 2.

Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp 50 50 nấm 2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 50 2. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các 51 dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro 2. Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 52 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo 2.

Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm 53 2. Phương pháp xử lý số liệu 54 ii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55 3. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H.

Kết quả so sánh, đánh giá và khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ 51 H. erinaceus trên diện hẹp 3. Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ 51 nghiên cứu tuyển chọn 3. Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảo 52 nghiệm 3.

Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại 57 của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu 3. Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấm 59 Đầu khỉ He1 3. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ 61 3. Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ 61 sợi nấm Đầu khỉ 3.

Xác định thời điểm phân lập 63 3. Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập 65 giống nấm Đầu khỉ a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi 65 giống gốc b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi 66 c.

Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự 68 sinh trưởng của sợi nấm 3. Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ 70 3. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm 73 Đầu khỉ dạng dịch thể 3. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể (dung tích 73 200ml) 3.

Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 73 3. Kết quả nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng 74 dịch thể trung gian cấp 1 3. Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến 76 iii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 3. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển 76 sang môi trường dịch thể 3.

Kết quả nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian 77 cấp 1 dạng dịch thể 3. Chế độ nuôi giống 77 a. Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 trên máy lắc 80 b. Nghiên cứu các chế độ nuôi giống trên máy khuấy từ 81 3.

Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm 82 Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 3. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích 85 2000ml – 5000ml) 3. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh 85 dưỡng 3. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống 86 trung gian cấp 2 nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 3.

Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch 87 thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2 3. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển 88 sang môi trường dịch thể 3. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung 89 tích 2-5 lít 3. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung 90 tích 2-5 lít 3.

Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống 92 trung gian cấp 2 dạng dịch thể 3. Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít 95 3. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống thể 95 tích 120 lit 3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng 95 môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng 3.

Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch 96 thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít iv CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 3. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên 97 men thể tích 120 lít 3. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của nuôi trồng 98 dạng dịch thể, thể tích 120lit (nghiên cứu thời gian lên men) 3.