Luận án tiến sĩ: Tạo kháng nguyên S của virus PEDV trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana
Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá nhằm phát triển phương pháp sản xuất vaccine hiệu quả.
Luan An
Luận án tiến sĩ
Năm xuất bản
Số trang
201
Thời gian đọc
31 phút
Lượt xem
0
Lượt tải
0
Phí lưu trữ
50 Point
Tổng quan nhanh
- Chủ đề:
- 1. Tạo kháng nguyên protein S PEDV trên cây thuốc lá
- Số trang:
- 201 trang
- Trường:
- Học viện Khoa học và Công nghệ
- Chuyên ngành:
- Công nghệ sinh học
- Tác giả:
- Hồ Thị Thương
- Năm:
- 2023
Tóm tắt nội dung luận án
I. Tạo kháng nguyên protein S PEDV trên cây thuốc lá
Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Tác nhân chính là virus dịch tiêu chảy cấp ở heo. Bệnh lây lan rất nhanh trong đàn. Tỷ lệ chết ở lợn con theo mẹ có thể lên đến 100%. Nghiên cứu tập trung tạo kháng nguyên protein S PEDV trên cây thuốc lá nhằm hướng tới giải pháp vắc-xin thế hệ mới. Protein S đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết và xâm nhập tế bào vật chủ. Việc sản xuất kháng nguyên này trên thực vật mở ra hướng đi an toàn, kinh tế và bền vững. Quy trình tận dụng sinh khối thực vật để tạo lượng lớn protein tái tổ hợp. Sản phẩm hướng tới khả năng ứng dụng thực tiễn cao trong phòng chống dịch bệnh nguy hiểm trên đàn lợn.
1.1. Tác hại nguy hiểm của virus dịch tiêu chảy cấp ở heo
Virus dịch tiêu chảy cấp ở heo thuộc họ Coronaviridae. Virus tấn công mạnh vào tế bào nhung mao ruột non của lợn. Bệnh gây teo nhung mao và mất nước cấp tính. Lợn con dưới hai tuần tuổi chịu ảnh hưởng nặng nề nhất. Triệu chứng lâm sàng gồm nôn mửa, tiêu chảy phân lỏng và suy kiệt nhanh. Tỷ lệ tử vong tại các ổ dịch bùng phát thường đạt mức tuyệt đối. Bệnh lây qua đường phân - miệng với tốc độ chóng mặt. Thiệt hại kinh tế đối với các trang trại chăn nuôi tập trung là vô cùng lớn. Các chủng PEDV mới liên tục biến đổi di truyền. Điều này tạo áp lực lớn cho công tác kiểm soát dịch bệnh truyền nhiễm trong chăn nuôi thú y hiện đại.
1.2. Những hạn chế lớn của vắc xin PEDV truyền thống
Vắc-xin bất hoạt và vắc-xin nhược độc truyền thống bộc lộ nhiều điểm yếu. Vắc-xin nhược độc tiềm ẩn nguy cơ phục hồi độc lực. Quá trình sản xuất vắc-xin truyền thống đòi hỏi hệ thống nuôi cấy tế bào phức tạp. Chi phí duy trì phòng thí nghiệm đạt chuẩn an toàn sinh học rất cao. Hiệu quả bảo hộ chéo giữa các chủng virus PEDV khác phân nhóm di truyền thường rất thấp. Chủng PEDV nhóm G2a đang lưu hành phổ biến tại Việt Nam làm giảm tác dụng của vắc-xin gốc G1a cổ điển. Do đó, nhu cầu phát triển vắc-xin thực vật cho lợn với độ an toàn cao và chi phí thấp trở nên cực kỳ cấp thiết. Công nghệ mới giúp đáp ứng nhanh các biến chủng virus nổi trội.
II. Công nghệ biểu hiện protein tái tổ hợp trên thực vật
Biểu hiện protein tái tổ hợp trên thực vật đang trở thành xu hướng công nghệ sinh học đột phá. Nền tảng này cho phép tổng hợp các chuỗi polypeptide phức tạp với cấu trúc chuẩn xác. Hệ thống tế bào thực vật thực hiện tốt quá trình biến đổi sau dịch mã. Quá trình glycosyl hóa diễn ra tương tự như ở tế bào động vật có vú. Điều này đảm bảo tính kháng nguyên tự nhiên của protein đích. Phương pháp biểu hiện tạm thời giúp rút ngắn thời gian thu hoạch sinh khối kháng nguyên xuống còn vài ngày. Chi phí đầu tư nhà xưởng và môi trường nuôi cấy thấp hơn nhiều so với hệ thống vi sinh vật hay tế bào động vật. Nền tảng thực vật loại bỏ hoàn toàn rủi ro nhiễm mầm bệnh từ động vật.
2.1. Đột phá từ hệ thống molecular farming cây thuốc lá
Molecular farming cây thuốc lá mang lại hiệu suất biểu hiện sinh học vượt trội. Cây thuốc lá phát triển nhanh và cho sinh khối lá rất lớn trong thời gian ngắn. Hệ thống này không tham gia vào chuỗi cung ứng thực phẩm của con người. Điều này hạn chế tối đa nguy cơ phát tán gen chuyển ra nông sản thương mại. Khả năng nhân rộng quy mô sản xuất diễn ra dễ dàng chỉ bằng cách tăng diện tích gieo trồng trong nhà kính. Chi phí mở rộng quy mô sản xuất kháng nguyên rẻ hơn hàng chục lần so với công nghệ lên men truyền thống. Molecular farming được đánh giá là giải pháp lý tưởng cho việc sản xuất protein kháng nguyên phòng ngừa dịch bệnh cho vật nuôi.
2.2. Lợi thế của cây Nicotiana benthamiana và Nicotiana tabacum
Hai loài thực vật Nicotiana benthamiana và Nicotiana tabacum được sử dụng phổ biến nhất trong công nghệ sinh học thực vật. Trong đó, Nicotiana benthamiana có hệ miễn dịch tự nhiên suy giảm nhẹ. Đặc điểm này giúp cây tiếp nhận vật liệu di truyền ngoại lai rất thuận lợi. Mức độ biểu hiện protein đích trong mô lá Nicotiana benthamiana đạt tỷ lệ rất cao. Trong khi đó, Nicotiana tabacum cung cấp sản lượng sinh khối khổng lồ trên mỗi đơn vị diện tích đất trồng. Cả hai đối tượng thực vật đều dễ dàng thao tác trong phòng thí nghiệm. Việc ứng dụng linh hoạt hai loài thuốc lá này tạo điều kiện thuận lợi cho việc tối ưu hóa biểu hiện kháng nguyên protein S PEDV ở quy mô lớn.
III. Biểu hiện miền liên kết thụ thể COE PEDV ở thuốc lá
Miền liên kết thụ thể COE PEDV là vùng cấu trúc chứa các epitope trung hòa quan trọng nhất của virus. Vùng COE nằm trên tiểu phần S1 của protein gai bề mặt. Đoạn gen mã hóa kháng nguyên được tối ưu hóa bộ ba mã hóa để phù hợp với hệ dịch mã của thực vật. Quá trình tổng hợp gen nhân tạo giúp tăng cường tính ổn định của mRNA trong tế bào lá. Kháng nguyên COE tái tổ hợp được định vị chính xác trong các ngăn bào quan như mạng lưới nội chất. Thiết kế này giúp bảo vệ protein khỏi sự phân hủy của enzyme protease nội bào. Nồng độ kháng nguyên tích lũy trong lá đạt mức cao, tạo tiền đề cho quá trình tinh sạch và thử nghiệm sinh học.
3.1. Thiết kế vector biểu hiện và tối ưu gen kháng nguyên
Gen mã hóa miền liên kết thụ thể COE PEDV được phân tích dịch tễ học phân tử kỹ lưỡng. Trình tự gen được lựa chọn từ các chủng PEDV nhóm G2a gây bệnh phổ biến tại Việt Nam. Các nhà nghiên cứu tối ưu hóa codon để nâng cao hiệu suất dịch mã trong tế bào thực vật. Trình tự tín hiệu peptide được gắn vào đầu N nhằm hướng protein vào mạng lưới nội chất. Đuôi nhận biết 6xHis được gắn tại đầu C để phục vụ công đoạn tinh sạch bằng sắc ký ái lực. Vector biểu hiện thực vật mang promoter mạnh để kích hoạt phiên mã liên tục. Toàn bộ cấu trúc vector được kiểm tra tính chính xác bằng giải trình tự DNA trước khi chuyển nạp vào tế bào thực vật.
3.2. Chuyển gen trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đóng vai trò như phương tiện vận chuyển vector tái tổ hợp vào mô lá thực vật. Vi khuẩn mang plasmid biểu hiện được nuôi cấy đến mật độ quang thích hợp. Tế bào vi khuẩn sau đó được thu nhận và huyền phù trong dung dịch đệm chuyển nhiễm chuyên dụng. Hoạt chất acetosyringone được bổ sung để kích hoạt hệ thống gen độc lực Vir của vi khuẩn. Quá trình này giúp T-DNA mang đoạn gen kháng nguyên di chuyển hiệu quả vào nhân tế bào thực vật. Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens bảo đảm tính ổn định cao. Kỹ thuật này giúp chuyển đồng thời nhiều cấu trúc gen tái tổ hợp vào cùng một mô lá nhanh chóng.
3.3. Áp dụng phương pháp Agroinfiltration thu hồi protein
Phương pháp Agroinfiltration là kỹ thuật tiêm hoặc hút chân không đưa dịch huyền phù vi khuẩn vào khoảng gian bào lá thuốc lá. Vi khuẩn xâm nhập sâu vào mô lá và chuyển nạp T-DNA vào hàng triệu tế bào cùng lúc. Thời gian biểu hiện protein tái tổ hợp tối ưu thường đạt đỉnh từ 4 đến 6 ngày sau xâm nhiễm. Lá thuốc lá sau đó được thu hoạch và nghiền mịn trong nitơ lỏng với dung dịch đệm chiết xuất. Quá trình phân tích bằng điện di SDS-PAGE và Western blot xác nhận sự hiện diện của protein đích. Hiệu suất thu hồi kháng nguyên protein S PEDV đạt mức cao và giữ nguyên được đặc tính cấu trúc ban đầu.
IV. Phát triển vắc xin thực vật cho lợn chống PEDV nhóm G2a
Việc phát triển vắc-xin thực vật cho lợn nhắm vào các chủng PEDV nhóm G2a có ý nghĩa thực tiễn rất cao. Chủng G2a là nhóm virus có độc lực cao và biến chủng phức tạp nhất hiện nay tại các trang trại chăn nuôi. Kháng nguyên đơn lẻ thường có tính sinh miễn dịch yếu nếu không hình thành cấu trúc đa phân tử. Nghiên cứu đã tích hợp các motif cấu trúc đặc biệt để hỗ trợ quá trình oligomer hóa kháng nguyên. Việc hình thành cấu trúc trimer hoặc multimer mô phỏng chân thực hình thái tự nhiên của protein gai trên bề mặt hạt virus. Cấu trúc kháng nguyên đa diện giúp kích hoạt mạnh mẽ các tế bào trình diện kháng nguyên của hệ miễn dịch vật chủ.
4.1. Kháng nguyên COE PEDV kết hợp motif oligomer hóa pII
Motif GCN4-pII được gắn vào cấu trúc kháng nguyên nhằm thúc đẩy quá trình tự lắp ráp thành dạng trimer bền vững. Kháng nguyên tái tổ hợp COE/G2a-pII biểu hiện trên cây thuốc lá tạo thành các phức hợp oligomer đồng nhất. Phân tích bằng sắc ký rây phân tử và phản ứng liên kết chéo chứng minh sự hình thành phức hợp ba phân tử hoàn chỉnh. Cấu trúc trimer phơi bày tối đa các epitope trung hòa đặc hiệu trên bề mặt. So với dạng monomer đơn lẻ, kháng nguyên dạng oligomer pII kích thích sinh kháng thể trung hòa cao hơn rõ rệt. Đây là cải tiến then chốt giúp nâng cao giá trị ứng dụng của protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ thực vật.
4.2. Cấu trúc dung hợp COE S1D gia tăng hiệu quả sinh kháng thể
Nghiên cứu mở rộng cấu trúc kháng nguyên bằng cách dung hợp miền COE với tiểu vùng S1D của protein S. Cấu trúc dung hợp COE-S1D/G2a-pII bổ sung thêm các epitope quan trọng giúp mở rộng phạm vi đáp ứng miễn dịch. Protein dung hợp biểu hiện ổn định trong mô lá cây Nicotiana benthamiana với hàm lượng cao. Kháng nguyên này duy trì được cấu trúc bậc cao tự nhiên sau quá trình tinh chế. Kết quả kiểm nghiệm cho thấy phức hợp COE-S1D kích thích sản sinh nồng độ kháng thể trung hòa vượt trội. Sự phối hợp đa miền kháng nguyên giúp khắc phục hiện tượng trôi dạt kháng nguyên của các chủng virus dịch tiêu chảy cấp ở heo đang biến đổi.
V. Đánh giá tính sinh miễn dịch vắc xin thực vật cho lợn
Đánh giá tính sinh miễn dịch là bước quyết định để khẳng định tiềm năng ứng dụng của kháng nguyên thực vật. Thử nghiệm tiền lâm sàng được tiến hành bài bản trên mô hình chuột thí nghiệm và lợn nái mang thai. Kháng nguyên tinh sạch được phối trộn với chất bổ trợ miễn dịch thích hợp trước khi tiêm. Các chỉ tiêu huyết thanh học được theo dõi định kỳ sau các mũi tiêm tăng cường. Kết quả cho thấy đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào đều được kích hoạt mạnh mẽ. Kháng thể sinh ra có khả năng trung hòa trực tiếp virus sống trong thử nghiệm in vitro. Dữ liệu thực nghiệm chứng minh tính khả thi của vắc-xin thực vật cho lợn.
5.1. Thử nghiệm kích hoạt kháng thể IgG và IgA trên động vật
Thử nghiệm trên chuột và lợn ghi nhận sự gia tăng mạnh mẽ của kháng thể IgG và IgA đặc hiệu PEDV. Phương pháp ELISA và Western blot chứng minh kháng thể liên kết chọn lọc với kháng nguyên tái tổ hợp và virus tự nhiên. Nồng độ kháng thể IgG trong huyết thanh lợn mẹ duy trì ở mức cao suốt giai đoạn mang thai. Đặc biệt, kháng thể IgA tiết xuất hiện với nồng độ lớn trong sữa đầu của lợn nái sau sinh. Kháng thể trong huyết thanh có hoạt tính trung hòa mạnh đối với chủng PEDV G2a độc lực cao. Thử nghiệm cũng ghi nhận sự tăng sinh của các cytokine quan trọng, phản ánh hệ miễn dịch tế bào được kích thích hiệu quả.
5.2. Khả năng bảo hộ lợn con trước chủng PEDV độc lực cao
Lợn con bú sữa đầu từ lợn mẹ được tiêm kháng nguyên COE/G2a-pII nhận được lượng kháng thể thụ động dồi dào. Thử nghiệm công cường độc với chủng PEDV phân nhóm G2a độc lực cao được thực hiện để đánh giá mức độ bảo hộ. Lợn con ở nhóm đối chứng không tiêm phòng bị tiêu chảy nặng và chết trong vòng vài ngày sau nhiễm virus. Ngược lại, đàn lợn con có kháng thể mẹ truyền biểu hiện triệu chứng nhẹ và có tỷ lệ sống sót vượt trội. Tổn thương vi thể tại nhung mao ruột của lợn con được bảo vệ giảm rõ rệt. Kết quả khẳng định vắc-xin thực vật mở ra triển vọng to lớn trong việc bảo vệ đàn lợn sơ sinh.
Mục lục chi tiết luận án
Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung
Tải đầy đủ (201 trang)Trích đoạn nội dung luận án
Tải xuống để đọc toàn bộBỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Hồ Thị Thƣơng NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN S CỦA VIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN (PEDV) TRÊN CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA CÓ TÍNH SINH MIỄN DỊCH ĐỊNH HƢỚNG TẠO VACXIN THẾ HỆ MỚI LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii DANH MỤC VIẾT TẮT.vii DANH MỤC BẢNG. xi DANH MỤC HÌNH. xii MỞ ĐẦU.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới. Tình hình dịch bệnh PED tại Việt Nam.
Tác nhân gây bệnh của PED. Phân loại PEDV. Đặc điểm hình thái của PEDV. Đặc điểm cấu trúc hệ gen và chức năng của các protein PEDV.
Protein S của PEDV. Dịch tễ học phân tử các chủng PEDV trên thế giới. Dịch tễ học phân tử của các chủng PEDV tại Việt Nam. Vacxin phòng PEDV.
Vacxin bất hoạt và vacxin nhược độc. Vacxin tiểu đơn vị. Vacxin axit nucleic. Các vấn đề tồn tại trong phát triển vacxin phòng PEDV.
Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật. Hệ thống biểu hiện tạm thời trên thực vật. Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật phòng PEDV trên thế giới. Motif GCN4-pII và motif tp của IgM.
Vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật phòng các bệnh động vật tại Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP. Chủng vi sinh vật, tế bào và plasmid. Nguồn vật liệu thực vật.
Nguồn vật liệu động vật. Thiết bị và vật tư. Phƣơng pháp. Thu thập thông tin, tách dòng, tối ưu mã biểu hiện và tổng hợp nhân tạo đoạn gen mã hóa protein S.
Thiết kế các vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp. Biểu hiện các kháng nguyên tái tổ hợp tạm thời trong cây thuốc lá N. Phân tích mức độ biểu hiện của các kháng nguyên tái tổ hợp bằng SDS-PAGE và Western blot. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của các kháng nguyên tái tổ hợp.
Nhân nuôi và tinh sạch PEDV từ tế bào nuôi cấy. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG, IgA, IgM đặc hiệu PEDV trong huyết thanh chuột bằng ELISA. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV trong huyết thanh chuột bằng Western blot.
Phân tích khả năng kích thích sinh cytokine trong huyết thanh chuột. Phân tích khả năng trung hòa PEDV của huyết thanh chuột. Gây đáp ứng miễn dịch trên lợn mẹ và công cường độc trên lợn con. Gây đáp ứng miễn dịch trên lợn con với kháng nguyên COE- S1D/G2a-pII.
Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG và IgA đặc hiệu PEDV trong huyết thanh lợn bằng ELISA. Phân tích đáp ứng sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV trong huyết thanh lợn bằng Western blot. Phân tích khả năng kích thích sinh cytokine trong huyết thanh lợn. Phân tích khả năng trung hòa PEDV của huyết thanh lợn.
Phương pháp xử lý thống kê. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a- pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G1a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng.
Biểu hiện kháng nguyên COE/G1a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G1a-pII. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp trên chuột. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a- pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam.
Thu thập thông tin, lựa chọn và tách dòng gen mã hóa protein S của chủng PEDV gây bệnh tại Việt Nam. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G2a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng. Biểu hiện kháng nguyên COE/G2a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N.
Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G2a-pII. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G2a-pII bằng SEC và phản ứng liên kết chéo. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII trên lợn. Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên COE- S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam.
Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa các kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp, S2/G2a-pII và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng. Biểu hiện các kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tạm thời trong lá thuốc lá N. Tinh sạch và phân tích đặc điểm oligomer của các kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp.
Đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp COE-S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII trên chuột. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII trên lợn. Mức độ biểu hiện và khả năng thu hồi của các kháng nguyên tái tổ hợp từ lá thuốc lá N. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII trên chuột.
Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a pII trên lợn nái và khả năng bảo hộ lợn con chống lại chủng PEDV G2a độc lực cao. So sánh tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp COE- S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII với kháng nguyên COE/G2a-pII trên chuột. So sánh tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII với kháng nguyên COE/G2a-pII trên lợn con. 122 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.
126 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.128 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 129 vii DANH MỤC VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên nguyên gốc tiếng Tên tiếng việt anh aa amino acid axit amin A. tumefaciens Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens tumefaciens Act1-I Rice actin 1 gene - I Gen mã hóa actin lúa 1-I bp Base pair Cặp base BS3 Bis[sulfosuccinimidyl] Bis[sulfosuccinimidyl] suberate suberate CaMV Cauliflower mosaic virus Virus khảm súp lơ Co1 M cell-targeting ligand Phối tử nhắm mục tiêu tế bào M COE CO-26K equivalent CO-26K tương đương CTB Cholera toxin B subunit Tiểu đơn vị độc tố tả B DAB Diaminobenzidine Diaminobenzidine DCpep Dendritic cell peptide Tín hiệu tế bào tua DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribo nucleotide Deoxyribo nucleotit triphotphat triphosphate E. coli Escherichia coli Escherichia coli E Elute Dịch chứa protein tinh sạch ELISA Enzyme-linked Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch immunosorbent assay liên kết với enzyme ELP Elastin-like polypeptide Polypeptit giống Elastin Fc Fragment crystallizable Mảnh kết tinh Dịch chảy qua cột sau khi đưa FT Flow through hỗn hợp dịch chiết thô trộn Ni- sepharose lên cột HA Hemagglutinin Hemagglutinin HR1 Heptad repeat region 1 Vùng lặp lại Heptad 1 viii HRP Horseradish peroxidase Peroxidaza cải ngựa HR2 Heptad repeat region 2 Vùng lặp lại Heptad 2 IFN-γ Interferon gama Interferon gama IgA Immunoglobulin A Immunoglobulin A IgG Immunoglobulin G Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M Immunoglobulin M IMAC Immobilized metal ion Sắc ký ái lực kim loại cố định chromatography INDEL Insertion deletion Chèn xóa Kb Kilobase Kilobase kDa Kilodalton Kilodalton LB Luria and Bertani Luria and Bertani LTB Heat-labile enterotoxin B Enterotoxin B tiểu đơn vị subunit Escherichia không bền nhiệt ở Escherichia M Membrane Màng mARN Messenger ribonucleic Axit ribonucleic thông tin acid N.
benthamiana Nicotiana benthamiana Nicotiana benthamiana NTD N‐terminal domain Miền tận cùng đầu N N Nucleocapsid Vỏ bọc nhân OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate-buffered saline Đệm muối phosphat PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PED Porcine epidemic diarrhea Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn PEDV Porcine epidemic diarrhea Virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở virus lợn pII GCN4pII GCN4pII PIGS Polymer immunoglobulin Polymer immunoglobulin G G PLGA Poly-lactic-co-glycolic- Axit poly-lactic-co-glycolic acid ix RAmy3D Promoter rice a-amylase Vùng gen khởi động alpha- 3D amylase 3D lúa RE Raw extract Dịch thô RT-PCR Reverse transcript Phản ứng sao chép chuỗi polymerase chain reaction polymerase ngược S Spike Spike S1 S1 subunit of spike Tiểu phần S1 của protein Spike protein S2 S2 subunit of spike Tiểu phần S1 của protein Spike protein SEC Size exclusion Sắc ký lọc gel chromatography Sodium dodecyl sulfate Điện di gel polyacrylamide SDS-PAGE polyacrylamide gel sodium dodecyl sulfat electrophoresis TCID50 Median tissue culture Liều gây nhiễm 50% tế bào infectious dose TGEV Transmissible Virus gây bệnh viêm dạ dày gastroenteritis virus ruột truyền nhiễm trên lợn TMB 3,3‘,5,5‘ 3,3‘,5,5‘ tetramethylbenzidine tetramethylbenzidine TMV Tobacco mosaic virus Virus khảm thuốc lá Trình tự đầu 5‘ chưa được TOL TMV omega-prime leader dịch mã của virus khảm thuốc lá TSP Total soluble protein Protein tan tổng số tp tailpiece Mảnh đuôi VLP Virus-like particle Hạt giả virus W Wash Dịch rửa chảy qua cột sau khi bổ sung đệm rửa WT Wild type Loài hoang dã xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Tóm tắt về chức năng của các protein PEDV. Các loại vacxin phòng PEDV đã được thương mại hóa và cấp phép có điều kiện 16 Bảng 1. Các nghiên cứu về vacxin tiểu đơn vị phòng PEDV.
Các nghiên cứu phát triển vacxin tiểu đơn vị có nguồn gốc từ thực vật phòng PEDV 24 Bảng 2. Danh sách các chủng vi sinh vật, tế bào và plasmid. Danh sách các mồi được sử dụng trong nghiên cứu. Danh sách các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu.
Danh sách các thiết bị, vật tư được sử dụng trong nghiên cứu. Mức độ tích lũy của các kháng nguyên tái tổ hợp từ trong lá thuốc lá N. Độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi sau tinh sạch các kháng nguyên tái tổ hợp từ lá thuốc lá N. benthamiana bằng phương pháp IMAC 93 xii DANH MỤC HÌNH Hình 1.
Hạt PEDV được quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Cấu trúc hệ gen và cấu trúc hạt PEDV. Cấu trúc mô hình của protein S. Cấu trúc protein S của PEDV và các vùng chứa yếu tố quyết định kháng nguyên tương tác với kháng thể trung hòa.
Con đường lan truyền tiềm năng của PEDV trên toàn thế giới. Tạo đáp ứng miễn dịch khi tiêm vacxin tiểu đơn vị. Cấu trúc tinh thể của GCN4-pII. Sơ đồ cấu trúc của IgM dạng monomer (bên trái) và dạng pentamer.
Sơ đồ mô tả tóm tắt các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong luận án. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen mã hóa kháng nguyên COE/G1a-pII và tạo chủng A.
tumefaciens mang vector pCB301 tái tổ hợp tương ứng. Biểu hiện protein COE/G1a-pII tạm thời trên cây thuốc lá N. Kết quả điện di SDS-PAGE, nhuộm Coomassie blue (A) và Western blot (B) kiểm tra quá trình tinh sạch kháng nguyên COE/G1a-pII bằng IMAC. Xác định đặc điểm oligomer của kháng nguyên COE/G1a-pII dựa vào phản ứng liên kết chéo (A) và điện di không biến tính (B) và Western blot (C).
Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột với kháng nguyên COE/G1a. Phân tích đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể IgG đặc hiệu PEDV ở chuột được tiêm bằng phản ứng Western blot (A) và ELISA (B). Xác định mức độ đáp ứng sinh kháng thể IgA (A) và IgM (B) đặc hiệu với PEDV thông qua phản ứng ELISA .
Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ
Trích dẫn luận án này
Hồ Thị Thương (2023). Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá [Luận án tiến sĩ, Học viện Khoa học và Công nghệ]. LuanAn.net. https://luanan.net/nong-hoc/bao-ve-thuc-vat/nghien-cuu-tao-khang-nguyen-pedv-tren-cay-thuoc-la
Câu hỏi thường gặp
Luận án "Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá" nghiên cứu về vấn đề gì?
Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá nhằm phát triển phương pháp sản xuất vaccine hiệu quả.
Luận án "Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá" được bảo vệ tại trường nào?
Luận án này được bảo vệ tại Học viện Khoa học và Công nghệ. Năm bảo vệ: 2023.
Luận án "Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá" thuộc chuyên ngành gì?
Luận án "Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá" thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học. Danh mục: Bảo Vệ Thực Vật.
Luận án "Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá" có bao nhiêu trang?
Luận án "Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá" có 201 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.
Cách tải luận án "Nghiên cứu tạo kháng nguyên PEDV trên cây thuốc lá" về máy như thế nào?
Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.