Luận án: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá ZmDREB2A tăng cường tính chịu hạn ở ngô Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ZmDREB2A NHẰM TĂNG CƯỜNG TÍNH CHỊU HẠN ́ Ở MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM ́ ̀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2020 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ZmDREB2A NHẰM TĂNG CƯỜNG TÍNH CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Bùi Mạnh Cường HÀ NỘI – 2020 luan an i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của các Thầy và sự giúp đỡ tận tình của các đồng nghiệp Viện Nghiên cứu Ngô. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, tháng 07 năm 2020 TÁC GIẢ ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO luan an ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được cuốn luận án này, trong quá trình nghiên cứu và thực hiện, tôi luôn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các cơ quan, thầy cô, bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Trước tiên, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. Nông Văn Hải, TS. Bùi Mạnh Cường đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Lãnh đạo và tập thể cán bộ Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ngô đã tạo điều kiện thuận lợi, về vật chất, tinh thần trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ sinh học, Bộ môn Công nghệ gen, Phòng Khoa học HTQT đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng tri ân đối với những đồng nghiệp, gia đình và bạn bè là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập của mình. Hà Nội, tháng 07 năm 2020 Đoàn Thị Bích Thảo luan an iii MỤC LỤC MỤC LỤC. i DANH MỤC CÁC BẢNG.

viii DANH MỤC CÁC HÌNH. ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. xii MỞ ĐẦU. Mục tiêu nghiên cứu.

Đóng góp mới của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô.

Khái niệm hạn. Hạn không khí. Hạn toàn diện. Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô.

Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô. Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô trên thế giới. Ảnh hưởng của hạn đến sản xuất ngô ở Việt Nam. Tình hình nghiên cứu giống ngô chịu hạn.

Tình hình nghiên cứu, sử dụng giống ngô chịu hạn trên thế giới. Tình hình nghiên cứu ngô chịu hạn ở Việt Nam. Cơ chế sinh lý, sinh hóa liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật. Cơ chế phân tử trong phản ứng với hạn ở thực vật.

Vai trò của một số phân tử trong truyền tín hiệu điều hòa biểu hiện gen chịu hạn ở thực vật. Một số nhóm nhân tố phiên mã được quan tâm trong nghiên cứu chịu hạn. Nhân tố phiên mã AREB/ABF. Nhân tố phiên mã NAC.

Nhóm nhân tố phiên mã bZIP. Nhân tố phiên mã AP2/ERF .25 luan an iv 1. Một số nghiên cứu về nhân tố phiên mã trong phản ứng hạn trên thực vật ở nước ta. Một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã Dreb2A trong phản ứng chịu hạn ở cây trồng.

Ứng dụng ngô biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam. Tiềm năng ứng dụng ngô biến đổi gen. Sử dụng ngô biến đổi gen trên thế giới. Nghiên cứu và sản xuất ngô biến đổi gen ở Việt Nam.

Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong phân tích cây chuyển gen. Chọn lọc thể chuyển gen bằng gen chỉ thị. Phân tích cây chuyển gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR.

Phương pháp xác định số bản sao (copy) trong cây chuyển gen. Phân tích biểu hiện gen. Phương pháp phân tích sử dụng trong nhà lưới và đồng ruộng. Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển.

Phân tích đặc điểm di truyền và nhận biết thể đồng hợp tử của thế hệ sau. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu thực vật. Chủng vi sinh vật.

Vector và oligonucleotide. Môi trường nuôi cấy. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp xác định dòng ngô có khả năng tái sinh cao.

Phương pháp theo dõi đặc điểm nông sinh học, chọn tạo dòng làm vật liệu chuyển gen. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện gen ZmDREB2A. Thiết kế vector biểu hiện trong tế bào thực. Tạo dòng vi khuẩn A.

tumefaciens mang vector chuyển gen. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A. Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp. Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm.

Quy trình biến nạp gen. Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen ZmDREB2A. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR. Đánh giá sự phân ly của gen ZmDREAB2A qua các thế hệ.

Phân tích cây chuyển gen bằng southerm blot. Đánh giá sự biểu hiện của gen thông qua RT-PCR. Tạo kháng thể đa dòng kháng protein ZmDREB2A tái tổ hợp. Biểu hiện protein ZmDREB2A trong tế bào vi khuẩn E.

Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột. Xác định hàm lượng Chlorophyll, proline, cacbonhydrate trong cây chuyển gen. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll tổng số. Phương pháp xác định hàm lượng proline.

Phương pháp xác định hàm lượng cacbohydrate không cấu trúc (NSC). Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen. Đánh giá khả năng chịu hạn bằng thí nghiệm gây hạn nhân tạo ở giai đoạn cây con theo phương pháp của Camacho. Đánh giá khả năng chịu hạn bằng thí nghiệm gây hạn nhân tạo ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau theo phương pháp của Zaidi.

Các kỹ thuật được dùng đánh giá cây chuyển gen. Tách chiết, định lượng DNA .65 a, Tách chiết DNA plasmid .65 b, Tách chiết DNA tổng số từ lá ngô. Tách chiết, định lượng RNA từ mô thực vật. Điện di DNA/RNA trên gel agarose.

Tổng hợp cDNA. Kỹ thuật PCR khuếch đại gen ZmDREB2A. Phương pháp giải trình tự và so sánh. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .70 luan an vi 3. Đánh giá khả năng tái sinh và đặc điểm nông học của một số vật liệu. Đánh giá khả năng tái sinh của một số vật liệu nghiên cứu. Đặc điểm nông, sinh học của các dòng có tỷ lệ tái sinh cao.

Thời gian sinh trưởng. Đặc điểm hình thái. Khả năng chống chịu. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất.

Thiết kế và biến nạp vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDreb2A vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2A. Phân tích và tổng hợp gen ZmDreb2A. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2A.

Biến nạp cấu trúc vector chứa gen ZmDREB2A-S vào một số dòng ngô Việt Nam thông qua vi khuẩn A. Chuyển gen ZmDREB2A-S vào các dòng ngô K1, K3, K7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR đối với các cây chuyển gen ở thế hệ T0. Kết quả giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A.

Đánh giá khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0. Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen ZmDREB2A ở các thế hệ T1, T2, T3. Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 bằng phương pháp PCR. Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T2 bằng phương pháp PCR.

Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T3 bằng phương pháp PCR. Kết quả giải trình tự cấu trúc biểu hiện Ubi::ZmDREB2A:: 35S trên cây ngô chuyển gen. Kết quả PCR, giải trình tự promoter Ubiquitin và so sánh với trình tự gốc. Kết quả PCR, giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A và so sánh với trình tự gốc.

Kết quả PCR, giải trình tự terminator 35S và so sánh với trình tự gốc .109 luan an vii 3. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDREB2A bằng kỹ thuật lai Southern. Kết quả DNA tổng số được cắt bằng enzyme giới hạn. Kết quả xác định tín hiệu lai Southern blot.

Xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen chuyển ZmDREB2A trên cây ngô chuyển gen bằng kỹ thuật RT-PCR .1 Kết quả PCR khi sử dụng cặp mồi Actin. Kết quả PCR khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmDREB2A. 117 sản phẩm PCR từ cDNA dòng K7-4. Kiểm tra protein ZmDREB2A bằng thẩm tách miễn dịch (Western Blot).

Xác định hàm lượng Chlorophyll, Proline, Cacbonhydrate trong cây chuyển gen và đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen. Xác định hàm lượng chlorophyll ở cây chuyển gen ZmDREB2A. Xác định hàm lượng proline ở cây chuyển gen ZmDREB2A. Xác định hàm lượng carbohydrate không cấu trúc ở cây chuyển gen ZmDREB2A .