Luận án tiến sĩ: Ứng dụng CRISPR/Cas9 chỉnh sửa OsSWEET14 kháng bệnh bạc lá lúa BT7

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ok VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- VŨ HOÀI SÂM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội – 2023 Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- VŨ HOÀI SÂM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học; Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Phạm Xuân Hội 2. Nguyễn Duy Phương Hà Nội - 2023 Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của các Thầy hướng dẫn, với kinh phí được hỗ trợ từ Đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen để cải tạo tính trạng mùi thơm và kháng bạc lá trên một số giống lúa chủ lực của Việt Nam”, năm 2017-2020. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ, hợp tác cho việc thực hiện luận án này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ dẫn rõ nguồn gốc. Tác giả luận án Vũ Hoài Sâm Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô giáo, các tập thể, cá nhân cùng các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. Phạm Xuân Hội và TS.

Nguyễn Duy Phương – những người Thầy đã hết sức tận tình hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu cũng như hoàn thành luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Cao Lệ Quyên (chủ nhiệm đề tài), cùng các cán bộ Bộ môn Bệnh học phân tử đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di truyền nông nghiệp và phòng Khoa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và triển khai thí nghiệm.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu, đồng nghiệp, em Nguyễn Thị Hương và các em phòng Công nghệ Sinh học nơi công tác đã tạo điều kiện cho tôi được đi học và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc và học tập. Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các anh, chị, em Ban Thông tin và Đào tạo, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện hồ sơ luận án. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn bên cạnh, động viên khích lệ, tiếp thêm sức mạnh và nghị lực để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Vũ Hoài Sâm Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN……………………………………………….ii MỤC LỤC……………………………………………………………………….iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT……………………………………………….v DANH MỤC BẢNG……………………………………………………….vii DANH MỤC HÌNH…………………………………………………….viii MỞ ĐẦU…………………………………………………………….

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .1 Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 .1 Giới thiệu chung về công nghệ chỉnh sửa gen .2 Cấu trúc và cơ chế chỉnh sửa của công nghệ CRISPR/Cas9 .3 Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong khoa học cây trồng .2 Giới thiệu về bệnh bạc lá ở lúa và vi khuẩn gây bệnh .2 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa .3 Gen OsSWEET14 và mối liên hệ với vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa .3 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá .1 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá dựa trên gen kháng .2 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá dựa trên gen “nhiễm” .4 Giống lúa BT7 và các nghiên cứu cải tiến giống lúa BT7.1 Giới thiệu chung về giống lúa BT7 .2 Bệnh bạc lá trên giống lúa BT7 .3 Nghiên cứu cải tiến di truyền giống lúa BT7 .5 Chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .1 Vai trò của chuyển gen nhờ A. tumefaciens đối với CRISPR/Cas9.2 Hiệu quả chuyển gen lúa nhờ A.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến q chuyển gen vào IE lúa .4 Nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa BT7 nhờ A. NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP .1 Đối tượng nghiên cứu .2 Vật liệu nghiên cứu. 43 Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế iv 2.2 Nội dung nghiên cứu .3 Phương pháp nghiên cứu .1 Các kĩ thuật chung trong nghiên cứu sinh học phân tử .2 Tối ưu quy trình chuyển gen vào giống lúa BT7 sử dụng IE.3 Đánh giá sự tương tác giữa vi khuẩn Xoo và OsSWEET14 trên BT7 .4 Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT .5 Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT .6 Đánh giá đặc điểm của dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT .4 Phương pháp xử lý số liệu.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7 .1 Tối ưu hệ thống tái sinh in vitro từ IE cho giống lúa BT7 .2 Tối ưu quy trình chuyển gen vào IE lúa BT7 qua A.3 Quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thông qua A.2 Thiết kế cấu trúc T- DNA chỉnh sửa SW14-BT .1 Nghiên cứu sự tương tác giữa VXO và OsSWEET14 ở giống lúa BT7 .2 Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT .3 Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT. tumefaciens mang cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT .2 Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT vào lúa BT7 .3 Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình của dòng lúa BT7 tái sinh .4 Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình của dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen T1 .4 Đánh giá đặc điểm của lúa BT 7 chỉnh sửa SW14-BT.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT .2 Nghiên cứu biểu hiện OsSWEET14 trong dòng lúa chỉnh sửa SW14-BT .3 Đánh giá khả năng kháng bạc lá của lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT. 123 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………….……………128 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN……….129 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………….146 Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt Alt-NHJI : Alternative non-homologous Ghép nối tận cùng không end joining tương đồng thay thế AS : Acetosyringone BAP : 6-benzyl amino purine BLB : Bacterial leaf blight Bệnh bạc lá do vi khuẩn BT7 : Bacthom7 cultivar Giống lúa Bắc thơm 7 Cas9 : CRISPR-associated 9 cDNA : Complementary Trình tự DNA bổ sung Deoxiribonuceic acid cNHEJ : Classical non-homologous end- Ghép nối tận cùng không joinng tương đồng gốc CRISPR : Clustered Regularly Nhóm trình tự ngắn, đối Interspaced Short Palindromic xứng, lặp lại phổ biến Repeats crRNA : CRISPR RNA Cs : Et al. (and others) Cộng sự CTAB : Cetyl three methylammonium bromide DAP : Days after pollination Ngày sau thụ phấn DNA : Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DSB : DNA double-strand break Đứt gãy DNA sợi đôi EBE : Effector binding element Yếu tố liên kết thụ thể gRNA : guide RNA RNA dẫn đường HDR : Homology directed repair Sửa chữa ADN theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng HPT : Hygromycin phosphotransferase IE : Immature embryos Phôi non LB : Luria-Bertani medium Môi trường Luria-Bertani nuôi vi khuẩn MMEJ : Microhomology-mediated end- Ghép nối tận cùng tương joining đồng nhỏ NAA : α-naphthalene acetic acid Axit α-naphthalene acetic NHEJ : Non-homologous end joining Ghép nối tận cùng không tương đồng Nu : Nucleotide NST : Chromosome Nhiễm sắc thể Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế vi OD : Optical density Mật độ quang học PAM : Protospacer adjacent motif Trình tự gần protospacer PCR : Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RFLP : Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn giới Polymorphisms hạn PGRs : Plant growth regulators Chất điều hòa sinh trưởng thực vật R gene : Resistance gene Gen kháng RNA : Ribonucleic acid Axit ribonucleic RT-PCR : Reverse transcriptase- Phản ứng chuỗi polymerase polymerase chain-reaction phiên mã ngược SD : Standard Deviation Độ lệch chuẩn SDSA : Synthesis-dependent strand Ghép sợi phụ thuộc vào sự annealing tổng hợp S gene : Susceptibility gene Gen nhiễm sgRNA : Single guide RNA RNA dẫn đường sợi đơn SNP : Single nucleotide Đa hình nucleotide đơn polymorphism SPSS : Statistical Package for the Phân mềm thống kê khoa học Social Sciences xã hội SSA : Single-strand annealing Ghép sợi đơn SW14-BT : Promoter OsSWEET14 giống lúa Bắc thơm 7 SWEET : Sugar will eventually be Protein vận chuyển đường exported transporters T-DNA : Transfer DNA DNA nhảy T3SS : Type III secretion system Hệ thống chất tiết loại III T7E1 : T7 Endonuclease I TAL : Transcription activator-like Protein giống yếu tố hoạt hóa phiên mã TALEN : Transcription activator-like Nuclease chứa thụ thể giống effector nucleases yếu tố hoạt hóa phiên mã TE : Tris-EDTA VXO : Vietnam Xanthomonas oryzae Vi khuẩn Xanthomonas pv.

oryzae oryzae pv. oryzae thu thập ở Việt Nam Xoo : Xanthomonas oryzae pv. Vi khuẩn oryzae ZFN : Zinc-finger nuclease Nuclease ngón tay kẽm Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế vii DANH MỤC BẢNG TT bảng Tên bảng Trang 1.1 Đặc điểm chính của các công nghệ chỉnh sửa gen 6 1.2 Ứng dụng CRISPR/Cas9 cải tiến di truyền cây lúa 15 1.3 Hiệu quả chuyển gen thông qua A.1 Thang điểm đánh giá tính kháng bệnh bạc lá 65 3.1 Hiệu quả khử trùng của NaOCl 1,0% đối với hạt non giống lúa 67 BT7 3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng đến tỉ lệ tăng sinh của mô sẹo phát 69 sinh. từ IE lúa BT7 3.3 Ảnh hưởng của ánh sáng đến chất lượng mô sẹo phát sinh từ 70 IE lúa BT7 3.4 Ảnh hưởng của chất ĐHST và nước dừa đến khả năng tái sinh 72 chồi từ mô sẹo 3.5 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy 74 đến hiệu quả chuyển gen vào IE giống lúa BT7 3.6 Ảnh hưởng của tuổi IE đến hiệu quả chuyển gen vào lúa BT7 77 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến quá trình chuyển gen vào IE 79 giống lúa BT7 3.8 Trình tự và đặc điểm các sgRNA ứng viên chỉnh sửa SW14-BT 95 3.9 Phân tích hiệu quả hoạt động của sgRNA mang các crRNA 96 ứng viên chỉnh sửa SW14-BT 3.10 Trình tự DNA trong hệ gen lúa tương đồng với crRNA 97 3.11 Kết quả biến nạp cấu trúc pCas9/gRNA-SW14 vào lúa BT7 104 3.