Luận án Tiến sĩ: Thực vật, hóa học, tác dụng sinh học hai loài Giảo cổ lam (Gynostemma sp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN THỊ KIỀU MY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HAI LOÀI GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA SP. TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN THỊ KIỀU MY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HAI LOÀI GIẢO CỔ LAM GYNOSTEMMA SP. TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62.06 Người hướng dẫn khoa học: GS. Phạm Thanh Kỳ HÀ NỘI, NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS.

Phạm Thanh Kỳ. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tác giả Thân Thị Kiều My LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được nhiều hỗ trợ từ trường Đại học Dược Hà Nội, sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, được sự ủng hộ của bạn bè và gia đình. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.

Phạm Thanh Kỳ - người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn: Thầy cô giáo, nhóm nghiên cứu và các cán bộ đồng nghiệp tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội ; Các thầy cô giáo, các cán bộ tại bộ môn Thực vật, bộ môn Dược học cổ truyền, bộ môn Công nghiệp dược, bộ môn Dược lý – trường Đại học Dược Hà Nội ; Các cán bộ Phòng Đào tạo sau đại học, trường Đại học Dược Hà Nội ; Các cán bộ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ; Các cán bộ tại Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội ; đã giúp đỡ về chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi khi thực hiện luận án này. Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu, các cán bộ phòng ban, các bộ môn chuyên ngành trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng vô cùng cảm kích với sự ủng hộ của bạn bè và động viên của gia đình tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Xin trân trọng cảm ơn. Thân Thị Kiều My MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ. Vị trí phân loại của chi Gynostemma Blume. Phân bố các loài của chi Gynostemma Blume.

Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume. Đặc điểm thực vật của một số loài thuộc chi Gynostemma Blume. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử định danh các loài thuộc chi Gynostemma Blume. Thành phần hóa học loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.

Thành phần hóa học hai loài là đối tượng nghiên cứu. Tác dụng sinh học. 39 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nguyên liệu nghiên cứu.

Hóa chất, dung môi. Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu. Nghiên cứu về thực vật. Nghiên cứu thành phần hóa học.

Đánh giá độc tính cấp và các tác dụng sinh học. Xử lý số liệu. 55 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Đặc điểm hình thái thực vật.

Kết quả nghiên cứu sinh học phân tử. Kết quả giám định tên khoa học hai mẫu nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi học. Định tính các nhóm chất hữu cơ của hai loài nghiên cứu.

Phân lập các hợp chất từ hai loài nghiên cứu. Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập. Đánh giá độc tính cấp. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu.

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa. Đánh giá tác dụng gây độc với một số dòng tế bào ung thư. Về tác dụng hạ glucose máu. Về tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa.

Về tác dụng gây độc tế bào của các saponin phân lập được. 140 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ Ara α-L-arabinopyranosyl ALT Enzym Alanine Aminotransferase AST Enzym Aspartate Aminotransferase CC Column Chromatography- Sắc ký cột COSY Correclation spectrometry- Phổ COSY CS% Cell survival %- % tế bào sống sót Distorionless Enhancement by Polarisation DEPT Transfer- Phổ DEPT Dl Dược liệu DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Electrospray ionization mass spectroscopy -Khối ESI- MS phổ ion hóa điện tử EtOH Ethanol EtOAc Ethylacetat G. Gynostemma GCL Giảo cổ lam Gas Chromatoghraphy Mass Spectroscopy- Sắc kí GC-MS khí kết hợp khối phổ Glc β-D-glucopyranosyl Human hepatocellular carcinoma- Tế bào ung thư HL-60 bạch cầu người Heteronuclear multiple bond correlation- Phổ HMBC tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Proton Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR Spectrography- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton High performance liquid chromatography – Sắc HPLC ký lỏng hiệu năng cao High resolution Electrospray ionization mass HR- ESI- MS spectrometry- Phổ khối phân giải cao HSCs Hepatic Stellate Cells Heteronuclear Single Quantum Correlation- Phổ HSQC tương tác dị hạt nhân 1 liên kết Inhibitory concentration 50%- Nồng độ ức chế IC50 50% IFN Interferon IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M IR Infra red – phổ hồng ngoại ITS Internal transcribed spacer- nhóm gen nhân LD50 Lethal dose 50%- Liều gây chết 50% Low density lipoprotein- Lipoprotein tỷ trọng LDL thấp MDA Malonyl dialdehyd MeOH Methanol MS Mass spectrometry – Phổ khối 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl MTT tetrazolium bromid Nulear magnetic resonance – Phổ cộng hưởng từ NMR hạt nhân Nuclear Overhauser Effect Spectrometry -Phổ NOESY hiệu ứng hạt nhân Overhauser OD Optical density- Mật độ quang học Human ovarian cancer cell line- Dòng tế bào ung OVCAR-8 thư buồng trứng PAR Paracetamol Rha L-Rhamnopyranosyl SKLM Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo Time of flight mass spectrometry- Phổ khối đầu TOF- MS dò thời gian bay tt Thể trọng ttc Thể trọng chuột World Health Organization – Tổ chức y tế thế WHO giới Xyl D- Xylopyranosyl DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Saponin cấu trúc 2α,3β,20β-trihydroxydammar-24-en.

Saponin cấu trúc 3β,12β,20β trihydroxydammar-24en. Saponin cấu trúc 3β,12β,20R trihydroxydammar-24en. Saponin cấu trúc 2α,3β,12β,20β-tetrahydroxydammar-24-en. Saponin cấu trúc 3β,19,20β-trihydroxydammar-24-en.

Saponin cấu trúc 3β,12β,19,20β-tetrahydroxydammar-24-en. Saponin cấu trúc 2α,3β,20β-trihydroxydammar-24-en-12-on. Saponin cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-19-al. Các hợp chất Damulin.

Saponin cấu trúc có nhóm hydroxyl C21. Saponin cấu trúc có nhóm carboxyl C21. Saponin cấu trúc dammar-25-en. Saponin cấu trúc có hydroperoxyl tại vị trí C25.

Saponin cấu trúc 3β,12β,20β,26-tetrahydroxydammar-24-en. Saponin có nhóm hydroperoxyl ở C25 và hydroxyl ở C21. Saponin cấu trúc có mạch thẳng tại C17 biến đổi. Saponin cấu trúc 21-23 epoxydammaran.

Saponin cấu trúc 21-23 lacto-dammaran. Saponin cấu trúc 20-25 epoxydammaran. Saponin cấu trúc 20-24 epoxydammaran. Các saponin cấu trúc có vòng pentacyclic.

Tác dụng chống ung thư in vitro của G. Tác dụng chống ung thư thực nghiệm của G. Trình tự vùng gen ITS-rDNA của các loài/thứ trong chi Gynostemma thu thập từ Genbank dùng trong nghiên cứu. Kết quả định tính các nhóm chất trong hai loài.

Số liệu phổ NMR của GPWB 4. Số liệu phổ NMR của GPWB 3. Số liệu phổ NMR của GPWB 5. Số liệu phổ NMR của GPWB5.

Số liệu phổ NMR của GPWB 6. Số liệu phổ NMR của GPWB 6. Số liệu phổ NMR của GPWB 8. Số liệu phổ NMR của GPWB 8.

Số liệu phổ NMR của GPWB 8. Số liệu phổ NMR của GPWB 11. Số liệu phổ NMR của GPWB 11. Số liệu phổ NMR của KMV1.

Số liệu phổ NMR của KMV2. Số liệu phổ NMR của GPL4. Số liệu phổ NMR của hợp chất GPL7. Số liệu phổ của hợp chất GPL12.

Mối tương quan liều lượng và tỷ lệ % chuột chết. Mối tương quan liều lượng và tỷ lệ % chuột chết. Tác dụng hạ glucose máu của Gg, Gb. Ảnh hưởng của thuốc thử lên trọng lượng gan chuột.

Ảnh hưởng của thuốc thử lên hoạt độ AST huyết thanh chuột. Ảnh hưởng của thuốc thử lên hoạt độ ALT huyết thanh chuột. Ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ MDA. Hình ảnh vi thể gan chuột sau 10 ngày uống thuốc.

Khả năng gây độc của các mẫu trên 4 dòng tế bào. Các chất phân lập được từ G. Các saponin phân lập được từ G. 131 DANH MỤC HÌNH Hình 2.

Sơ đồ mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan. Ảnh chụp đặc điểm hình thái Giảo cổ lam G1 .Ảnh chụp đặc điểm hình thái Giảo cổ lam G3 .Mối quan hệ họ hàng của các mẫu Gynostemma spp. Nucleotid sai khác trên vùng gen ITS-rDNA giữa thứ G. molle (molle) và thứ G.

Nucleotid sai khác (chữ đậm) trên vùng gen ITS-rDNA giữa loài G. guangxiense (guangxiense) và loài G.Đặc điểm vi phẫu thân G.Đặc điểm vi phẫu lá Gynostemma guangxiense X. Một số đặc điểm bột Gynostemma guangxiense X.Đặc điểm vi phẫu lá G.burmanicum King ex Chakrav. Đặc điểm vi phẫu thân G.

burmanicum King ex Chakrav. Một số đặc điểm bột lá và thân Gynostemma burmanicum King ex Chakrav. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ G. burmanicum King ex Chakrav.

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G.Cấu trúc hợp chất GPWB3. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của GPWB 4. Cấu trúc hợp chất GPWB 3.Cấu trúc hợp chất GPWB5. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB 5.Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB 5.

Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB6. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB 6. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB 8. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB 8.

Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB 8.Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB 11. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC(H→C) chính của GPWB 11.Cấu trúc hóa học của KMV1.Cấu trúc hợp chất KMV2. Phổ khối phân giải cao của hợp chất GPL 4. cấu trúc hóa học của hợp chất GPL4.

Một số tương tác HMBC(H→C) chính của GPL4. Cấu trúc hóa học của hợp chất GPL 7. Phổ khối phân giải cao của hợp chất GPL7. Cấu trúc hóa học của hợp chất GPL 12.

So sánh đặc điểm hình thái G.guangxiense với bản mô tả. 124 ĐẶT VẤN ĐỀ Giảo cổ lam (Jiaogulan) được biết đến như một loại thực phẩm từ đầu thế kỷ XV ở Trung Quốc, nhưng phải đến năm 1976, khi nghiên cứu về các chất thay thế đường cho bệnh nhân tiểu đường, các nhà khoa học Nhật Bản mới phát hiện ra các saponin trong Giảo cổ lam giống với các saponin trong Nhân sâm [1].